RNA干擾作用于HIV-1vpr基因的篩選實驗研究

張 權(quán)，周 泉，何 艷，龔國忠，鄭煜煌，周華英，黃 娜

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RNA干擾作用于HIV-1vpr基因的篩選實驗研究

張 權(quán)，周 泉，何 艷，龔國忠，鄭煜煌，周華英，黃 娜

目的 篩選鑒定針對HlV-1vpr基因的小干擾RNA(siRNA)片段。方法 根據(jù)siRNA設(shè)計要求合成siRNA56、siRNA160和siRNA185寡核苷酸片段，分別轉(zhuǎn)染至含HIV-1vpr質(zhì)粒的HEK 293T細胞，并進行總RNA提取，采用Real-time PCR和Western blotting分別從核酸和蛋白水平對HIV-1vpr基因表達水平進行驗證。結(jié)果 siRNAs成功轉(zhuǎn)染含HIV-1vpr質(zhì)粒的HEK 293T細胞，降低了HIV-1vpr基因的表達水平，其中在RNA水平siRNA160組干擾抑制作用最強，抑制率為89%；在蛋白水平siRNA56組干擾抑制作用最強，抑制率為96%。結(jié)論 3個基因片段的siRNA均可以下調(diào)HIV-1vpr的表達水平，但存在差異性，為探索HIV/AIDS基因治療的可行性和高效性提供了可靠的實驗依據(jù)。

RNA干擾；HIV-1；HIV-1vpr基因；HEK293T細胞

張權(quán)，周泉，何艷，等.RNA干擾作用于HIV-1vpr基因的篩選實驗研究[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(14)：1671-1674.[www.chinagp.net]

Zhang Q，Zhou Q，He Y，et al.Screen and identify RNA interference on HIV-1vpr gene[J].Chinese General Practice，2015，18(14)：1671-1674.

目前HIV感染者/AIDS患者的主要治療手段仍是高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法 (HAART)，即通過不同的藥物聯(lián)合抑制HIV感染者體內(nèi)的病毒載量，改善免疫重建，減少和延緩機會性感染的發(fā)生[1]，但HAART不能完全清除病毒，且存在治療費用高、需終身聯(lián)合服藥、毒副作用大及產(chǎn)生耐藥突變等缺點[2-3]，所以研究者在不斷開發(fā)新的治療手段。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)即是近年來在基因治療領(lǐng)域中的新進展，在抗腫瘤、抗病毒等方面有較好的應(yīng)用前景。

HIV-1vpr基因?qū)儆贖IV基因組的4個輔助基因之一，編碼一個96氨基酸、14 kDa分子量的堿性vpr輔助蛋白，有促進病毒整合前復合物(PIC)的核運輸[4]、調(diào)節(jié)促進宿主基因轉(zhuǎn)錄[5]、反式激活HIV長末端重復序列(LTR)及某些異質(zhì)啟動子[6]、誘導宿主細胞G2/M期的停滯[7]、致感染細胞的凋亡[8]、抑制細胞內(nèi)pre-mRNA的剪接[9]等多項功能，參與了HIV病毒的多個致病環(huán)節(jié)和免疫損傷過程。本研究擬針對HIV-1vpr基因設(shè)計相關(guān)的小RNA分子并進行篩選鑒定，以確定最佳RNAi片段而進行后期研究。

1 材料與方法

1.1 材料 PRNAT-U6.1/Neo-HIV-1vpr質(zhì)粒由中南大學湘雅二醫(yī)院感染科研究室制備并保存；HEK293T細胞來自長沙艾佳生物技術(shù)有限公司；HIV-1vpr多克隆抗體購自Santa公司；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購自Jackson公司；SYBR Green qRCR Mix試劑盒購自TOYOBO公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒、超敏化學發(fā)光顯色試劑盒購自江蘇碧云天生物科技研究所。

1.2 方法

1.2.1 HIV-1vpr及β-actin引物合成 采用Primer 5.0軟件設(shè)計，并由長沙艾佳生物技術(shù)有限公司合成，HIV-1vpr上游引物序列為5′-AAGACCAAGGGCCACAGA-3′，下游引物為5′-CTTCCACTCCTGCCCAAGTA-3′,β-actin上游引物為5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′，下游引物為5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′。

1.2.2 小干擾RNA(siRNA)的制備 根據(jù)HIV-1vpr序列，遵循siRNA靶序列選擇要求選定分別對應(yīng)HIV-1vpr基因不同位點的3段序列，由Invitrogen公司采用化學合成法合成相應(yīng)的寡核苷酸片段，其中siRNA56序列為5′-CACUAGAGCUUCUAGAGGAGCUUAA-3′，siRNA160：5′-AUAAACAGCAGUUGUUGCAGAGUUC-3′，siRNA185：5′-UGGGCAGGAGUGGAAGCCAUAAUAA-3′。

1.2.3 siRNAs轉(zhuǎn)染HEK293T細胞 復蘇培養(yǎng)HEK293T細胞，以PRNAT-U6.1/Neo-HIV-1vpr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以僅含質(zhì)粒的單純HEK293T細胞組為對照組，將siRNA56、siRNA160、siRNA185 分別制成siRNA-lipo2000混懸液，室溫靜置20 min，分別加至含質(zhì)粒HEK293T細胞的24孔培養(yǎng)板中混合，設(shè)為3個實驗組，37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察并進行細胞收集，然后分別進行Real-time PCR和Western blotting檢測。

1.2.4 細胞總RNA的抽提及Real-time PCR 所收集細胞采用Trizol試劑抽提總RNA，取1 μl進行瓊脂糖電泳檢測。并以cDNA為模板進行Real-time PCR擴增，擴增引物各1 μl(10 μmol/L)，共30 μl反應(yīng)體系。擴增條件：95 ℃，3 min;95 ℃,10 s;58 ℃,30 s共35個循環(huán)，每次在延伸階段讀取熒光值。以僅含質(zhì)粒的單純HEK293T細胞組cDNA進行10倍梯度稀釋，繪制標準曲線。

1.2.5 Western blotting檢測 收集轉(zhuǎn)染細胞裂解樣品，Bradford 法測定蛋白質(zhì)樣品濃度，灌制SDS-PAGE凝膠，上樣，100 V電泳，至溴酚蘭剛跑出玻璃板即終止電泳轉(zhuǎn)膠至PVDF膜，封閉孵育2 h后加入稀釋的HIV-1vpr多克隆抗體(1∶500)孵育過夜，傾去一抗后加入稀釋的羊抗兔二抗(1∶6 000)孵育1 h，進行X線膠片顯影。最后通過膜再生進行內(nèi)參抗體β-actin孵育和顯色并掃描，采用IPP 6.0圖像分析軟件進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 總RNA樣本提取 電泳圖顯示電泳條帶清晰，大小一致(見圖1)，說明siRNA轉(zhuǎn)染細胞成功。

圖1 4個樣本總RNA提取電泳圖

2.2 siRNA對HIV-1vpr的體外干擾作用

2.2.1 Real-time PCR結(jié)果 利用Real-time PCR檢測各組siRNA干擾效率，對照組cDNA進行10倍梯度稀釋，繪制相對標準曲線，采用相對定量的方法對各組進行β-actin基因的內(nèi)均一化處理，分析siRNA各組中HIV-1vpr基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與對照組比較，siRNA56組、siRNA160組和siRNA185組HIV-1vpr基因的mRNA水平均明顯降低(對照組的2-△△Ct值為1.01，siRNA56組、siRNA160組、siRNA185組分別為0.68、0.11、0.59)，其中siRNA56組下降32%，siRNA160組下降89%,siRNA185組下降41%,提示siRNA能有效地下調(diào)HIV-1vpr基因的轉(zhuǎn)錄水平(見圖2)。

圖2 Real-time PCR檢測siRNA轉(zhuǎn)染后HIV-1vpr基因轉(zhuǎn)錄水平

Figure 2 Transcription level of siRNAs transfect HIV-1vpr gene detected by Real-time PCR

2.2.2 Western blotting結(jié)果 對照組在轉(zhuǎn)染48 h后可見HIV-1vpr蛋白呈較高水平表達，siRNA56組、siRNA160組和siRNA185組均僅見很弱的蛋白表達條帶，根據(jù)灰度分析發(fā)現(xiàn)siRNA56組HIV-1vpr蛋白表達水平抑制率為96%，siRNA160組、siRNA185組抑制率分別為37%和52%(見圖3～4)。

圖3 Western blotting檢測siRNAs轉(zhuǎn)染后干擾效果

圖4 Western blotting檢測siRNA轉(zhuǎn)染后HIV-1vpr基因表達水平

Figure 4 Expression levels of siRNAs transfect HIV-1vpr gene detected by Western blotting

3 討論

3.1 RNAi靶點的選擇 RNAi是近年發(fā)展起來的可用于抗腫瘤、抗病毒治療的新技術(shù)，而且已有研究證實此技術(shù)可以有效應(yīng)用于HIV的抗病毒治療，并取得了實質(zhì)性進展。RNA干擾技術(shù)在HIV感染者/AIDS患者治療方面的研究最初是以HIV-1病毒中編碼下列蛋白的基因作為RNAi的靶點：結(jié)構(gòu)蛋白Gag、Env和Pol酶，調(diào)控蛋白Tat和Rev，以及2個附屬蛋白Nef和Vif[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)沉默HIV-1的某個基因可以抑制病毒的復制，但不同的基因結(jié)果有一定差異。目前針對HIV-1vpr基因的RNA干擾報道較少。由于vpr輔助基因在HIV-1的傳播、致病能力和發(fā)病機制等諸多方面扮演著重要角色，研究HIV-1vpr的作用可能會進一步揭示AIDS的發(fā)病機制，從而為防治AIDS提供新的策略[13]。本研究選擇此目的基因作為RNAi的靶點,篩選針對HIV-1vpr基因的有效siRNA片段對HIV-1vpr基因的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平進行沉默，并分別在核酸和蛋白水平進行了驗證。

3.2 結(jié)果分析 本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，siRNA56組、siRNA160組和siRNA185組HIV-1vpr基因的mRNA水平均明顯降低，其中siRNA160組抑制率最高，對靶基因mRNA的降解作用最明顯；而在HIV-1vpr蛋白水平siRNA56組干擾抑制效果最強，達96%。本研究mRNA水平與蛋白表達水平不一致,可能是由于mRNA與蛋白在細胞中的表達差異有關(guān)，部分轉(zhuǎn)錄出來的mRNA可能不參與蛋白翻譯或某些蛋白表達量達到一定程度后出現(xiàn)飽和而關(guān)閉表達，而蛋白產(chǎn)生和降解的速度比較恒定，短期內(nèi)兩者的變化可能不一致；另一方面，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導是一個網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，蛋白表達可能受到其他旁路通道的影響,或存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。依此推論,mRNA水平的下調(diào)與蛋白水平的下調(diào)并非完全呈正相關(guān)的關(guān)系，其作用機制有待進一步研究。

3.3 展望 本研究通過RNAi技術(shù)，應(yīng)用化學合成的siRNAs寡片段轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，研究vpr基因特異性siRNA的基因沉默作用，實現(xiàn)高效導入靶細胞及穩(wěn)定表達siRNA的目的，篩選可有效抑制vpr基因表達的siRNA序列。目前由于siRNA的分子極性、細胞毒性及t1/2短等因素，在體內(nèi)的研究受限，為此人們陸續(xù)開發(fā)了核酸適配子嵌合體、陽離子鈦依賴的scFvCD7-9R抗體復合物等來高效介導siRNA轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)從而導致基因沉默[14-15]。但近年來的報道無論針對免疫逃逸、轉(zhuǎn)染效率還是抑制效率，均認為沉默多個病毒基因或聯(lián)合沉默病毒和宿主基因、相關(guān)的多個位點較單純采用某一個靶點更好，且有進一步研究證實構(gòu)建多個表達盒的方法較多個表達載體法、含數(shù)個dsRNA單元的單個轉(zhuǎn)錄法效率更高[16-17]。siRNA對HIV-1vpr基因在體外細胞中的表達有明顯抑制效應(yīng)，這對于阻斷HIV侵入宿主細胞及其相互作用有重要啟示，為HIV/AIDS抗病毒治療和預防研究提供理論基礎(chǔ)，同時證實了RNAi具備高效、穩(wěn)定、簡單、特異等優(yōu)勢和潛力，有望成為一種具有良好抗HIV-1療效的新方法。

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(本文編輯：趙躍翠)

Screen and Identify RNA Interference on HIV-1vpr Gene

ZHANGQuan，ZHOUQuan，HEYan，etal.

DepartmentofInfectiousDiseases,theSecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410011,China

Objective To screen and identify fragments of siRNA on HIV-1vpr gene.Methods This study designed and synthesized siRNA56,siRNA160 and siRNA185 oligonucleotide fragments according to siRNA design requirements,transfected them into HEK293T cells containing plasmids of HIV-1vpr genes,extracted total RNA and verified HIV-1vpr from levels of nucleic acid and protein by Real-time PCR and Western blotting.Results The siRNA successfully transfected HEK 293T cells containing HIV-1vpr plasmids and reduced the expression of HIV-1vpr genes.The inhibition rate of siRNA160 group was the highest in RNA level (89%) and that of siRNA56 group was the highest in protein level (96%).Conclusion The siRNAs of three gene fragments,which can decrease the expression HIV-1vpr,provide a reliable and efficient experimental basis for exploration of HIV/AIDs gene treatment.

RNA interference；HIV-1；HIV-1vpr gene；HEK293T cell

湖南省科學技術(shù)廳科技計劃項目(2014SK3097)

410011湖南省長沙市，中南大學湘雅二醫(yī)院感染科

R 394.114

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.14.017

2014-11-25；

2015-01-20)