轉OsDREB3基因大豆外源基因拷貝數的確定及標準分子的構建

孫喆，劉營，張明輝，李璐，高學軍

(農業(yè)部轉基因生物產品成分監(jiān)督檢驗測試中心(哈爾濱)，東北農業(yè)大學農業(yè)生物功能

基因重點實驗室，黑龍江 哈爾濱　150030)

轉OsDREB3基因大豆外源基因拷貝數的確定及標準分子的構建

孫喆，劉營，張明輝，李璐，高學軍

(農業(yè)部轉基因生物產品成分監(jiān)督檢驗測試中心(哈爾濱)，東北農業(yè)大學農業(yè)生物功能

基因重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150030)

摘要：為建立抗逆轉OsDREB3基因大豆快速穩(wěn)定的品系特異性檢測方法，本試驗通過實時Real-time PCR方法，以大豆凝集素基因(lectin)作為內源參照基因，確定了外源基因OsDREB3在轉OsDREB3基因大豆基因組中的拷貝數為單拷貝，為建立快速、有效的品系特異性檢測方法奠定基礎.同時，在原有構建的含4種轉基因大豆品系特異性序列的標準分子載體上又增加了轉OsDREB3基因大豆品系特異性序列，新構建了含有5種轉基因大豆品系特異性序列的標準分子及大豆內參照基因(lectin)，已完全滿足對現有國內覆蓋面最大的5種轉基因大豆同時、快速篩查檢測工作的需要.

關鍵詞：轉OsDREB3基因大豆；外源基因；拷貝數；標準分子

第一作者：孫喆(1980-)，女，實驗師，碩士，從事轉基因檢測技術方面的研究.E-mail:sunzhe1998@163.com

Determination of copy numbers ofOsDREB3 gene

and construction of standard molecular of

transgenicOsDREB3 soybean

SUN Zhe,LIU Ying,ZHANG Ming-hui,LI Lu,GAO Xue-jun

(Superivision and Test Center (Harbin) for Molecular Characteristics of Genetically Modified Plants,

Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Agricultural Genomics,Northeast

Agricultural University,Harbin 150030,China)

Abstract：To establish a fast and stable detection method for OsDREB3,a genetically modified (GMO) soybean,t the exogenous gene OsDREB3 was identified as a single copy gene in the genome by real-time quantitative PCR method and lectin gene as house-keeping gene,which laid a foundation for a rapid and effective detecting method of event specific genetically modified soybeans.At the same time,OsDREB3 event specific sequences were constructed to the multiple-target plasmid,a standard plasmid with four junction regions of genetically modified soybean events,and thus generate a new standard plasmid which can meet fully the demands of rapid detection work of all the five kinds of genetically modified soybeans.

Key words：OsDREB3 transgenic soybean;exogenous gene copy number;standard molecular

自1988年Hinchee首次報道成功獲得大豆轉基因植株以來，1994年美國孟山都公司成功研制出抗草甘膦除草劑轉基因大豆(RR大豆)，1995年獲準在美國商業(yè)化種植，轉基因大豆在國際上的種植面積不斷增加[1].我國已經成為最大的轉基因大豆進口國.隨著基因工程技術的不斷提高，轉基因大豆的類型也在不斷增加[2].目前，我國主要轉基因大豆類型有‘GTS40-3-2’‘A2704-12’‘A5547-127’‘MON89788’等，農業(yè)部已出臺了相應的檢測標準[3-6].由于地理環(huán)境的因素和優(yōu)越的抗逆性能，抗逆轉基因大豆越來越受到科研人員的重視.本研究所用的轉OsDREB3基因大豆是從水稻中分離得到的抗逆基因轉入到大豆中，以提高大豆的抗逆性狀.近年來，耐低溫抗逆轉基因大豆新品系‘OsDREB3’由于優(yōu)秀的抗逆性狀，已進入環(huán)境釋放或生產性試驗、或獲得安全證書的轉基因植物環(huán)境安全評價階段.因此，建立其快速、有效的轉基因檢測技術已成為迫切解決的問題.本研究中構建的含有轉基因大豆品系特異性基因片段的標準分子，能夠同時、快速、有效的對5種轉基因大豆進行檢測，獲得的轉OsDREB3基因大豆拷貝數及方法將為我國轉基因大豆安全評價做出一定貢獻.

1材料與方法

1.1試驗材料

轉OsDREB3基因大豆由東北農業(yè)大學大豆研究所提供；轉基因品種大豆‘MON89788’、轉基因大豆‘A2704-12’、轉基因大豆‘A5547-12’、轉基因大豆‘GTS 40-3-2’及非轉基因大豆由農業(yè)部生物產品成分監(jiān)督檢驗測試中心(哈爾濱)提供.

1.2試劑與儀器

dNTP、rTaqDNA聚合酶、Marker DL2000、DNA純化試劑盒，購自Axygen公司；定量PCR試劑盒，pMD18-T質粒及所需試劑購自大連寶生物工程有限公司；DNA Clontech Genome WalkerTM Universal Kit.引物合成和測序由Invitrogen公司完成.

PCR儀(德國Biometra，BiometraTgradient)、高速離心機(上海安亭，TDL-40B)、紫外分光光度儀(美國Beckman，DUR640)、凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP，G8000)、核酸電泳儀(杭州大和熱磁，GE-100)、核酸蛋白分析儀(DU 640，Beckman coulter).

1.3試驗方法

1.3.1DNA提取采用CTAB法，將100 mg樣品經預處理后提取總DNA[7].提取的總DNA溶于100 μL ddH2O中，測定其濃度后最終稀釋成100 ng/μL備用.用紫外分光光度計測定DNA溶液的D260與D280值，并計算D260/D280的比值來評價所提取DNA的質量，本研究中所用DNA的D值均在1.9左右.

1.3.2轉OsDREB3基因大豆外源基因拷貝數的確定

1.3.2.1品系特異性PCR引物設計以NCBI GeneBank序列為基礎.根據大豆內標準基因lectin基因序列(GeneBank序列號：K00821)、質粒pCAMBIA 1301(GenBank AF234297)和OsDREB3基因序列(GeneBank序列號：AY781349.1)，根據轉OsDREB3基因大豆 5’旁側序列，采用Primer 5.0設計引物[8].質粒標準品的構建及計算拷貝數所用引物見表1.

表1　質粒標準品構建及拷貝數所用引物序列及擴增片段大小

1.3.2.2內參基因和外源基因標準曲線的構建

1)內參lectin標準曲線的繪制試驗標準品選用非轉基因大豆做內參基因lectin標準對照，進行51，52，53，54，55梯度稀釋，經過Real-time PCR反應，獲得lectin基因標準曲線、擴增曲線.

2)OsDREB3標準曲線的構建選用含OsDREB3陽性質粒為標準對照，進行51，52，53，54，55梯度稀釋，經過Real-time PCR反應，獲得OsDREB3基因標準曲線.

1.3.2.3OsDREB3基因拷貝數的估算為排除其它因素的影響，保證試驗結果真實、有效，每個模板做3個平行，進行Real-time PCR擴增，獲得內參lectin基因Ct值與拷貝數對數值的相關標準曲線和OsDREB3基因Ct值與拷貝數對數值的相關性標準曲線，OsDREB3基因與內參基因lectin起始量比值即是OsDREB3在大豆基因組中的拷貝數.

1.3.3轉基因大豆標準分子構建

1.3.3.1引物設計標準分子所用引物的設計以NCBI GeneBank序列為基礎.依據OsDREB3基因序列(GeneBank序列號：AY781349.1)，引物采用Primer 5.0設計，新構建的標準分子所用引物見表2.為了構建含有OsDREB3特異片段的標準分子，將OsDREB3外源基因擴增后得到的片段大小700bp的特異片段連接到本實驗室自構建的商品化轉基因大豆陽性對照分子上[9].

表2　新標準分子所用的引物

1.3.3.2陽性標準分子的鑒定以重組質粒作為模板，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶.

2結果與分析

2.1轉OsDREB3基因大豆拷貝數的確定

2.1.1內參基因標準曲線的制作內參基因標準樣品選用非轉基因大豆，提取DNA后分別進行51，52，53，54，55梯度稀釋，經過Real-time PCR反應，得到各自的Ct值，通過Ct值與起始模板數的對數值之間存在的線性關系，獲得標準曲線方程.lectin基因含量標準曲線見圖1.轉OsDREB3基因大豆內參照基因以待檢x為LogDNA分子數，y為Ct值，建立了內參照基因標準曲線.標準曲線如圖1所示.內參照基因lectin標準曲線方程為y=-2.708x+38.896，R2= 0.995.標準曲線的相關系數R2接近1.

2.1.2OsDREB3基因標準曲線的制作制作OsDREB3基因標準曲線樣品選用OsDREB3表達載體質粒DNA，分別進行51，52，53，54，55梯度稀釋，經過Real-time PCR反應，得到各自的Ct值，通過Ct值與起始模板數的對數值之間存在的線性關系，獲得標準曲線方程.OsDREB3基因含量標準曲線見圖2.轉OsDREB3基因大豆外源基因以待檢x為LogDNA分子數，y為Ct值，建立了外源基因的標準曲線，如圖2所示.外源基因OsDREB3基因標準曲線方程為y=-3.679x+42.670，R2= 0.999，標準曲線的相關系數R2接近1.

圖1　lectin基因標準曲線

圖2　OsDREB3基因含量標準曲線

2.1.3OsDREB3基因拷貝數的計算采用CTAB法提取基因組，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳(圖3)，顯示基因組無蛋白質和RNA污染.

圖3　OsDREB3 DNA基因組凝膠電泳圖

采用絕對定量法計算轉OsDREB3基因大豆中基因邊界序列的拷貝數，檢測樣品做3個平行，獲得擴增曲線，熒光閾值的設定與制作標準曲線時相同.表3為采用7300分析軟件得到的樣品的Ct值及分子數.拷貝數的計算依照公式：拷貝數=待測品中外源基因分子數/(待測品中內參基因分子數×2).根據表4所得Ct值及拷貝數公式計算得，轉OsDREB3基因大豆拷貝數為1，即單拷貝.

表3　依據Lectin、OsDREB3基因的標準曲線所獲得的樣品Ct值及分子數

2.2轉OsDREB3基因大豆標準分子的構建

2.2.1目的基因的擴增選擇優(yōu)化好的PCR條件擴增轉OsDREB3基因大豆的目的基因.目的基因為覆蓋大豆基因組及載體序列的一段特異片段，大小為700 bp(圖4).

2.2.2酶切將OsDREB3質粒和原有標準分子經瓊脂糖凝膠電泳后回收，將回收后的OsDREB3基因目標片段與實驗室原有標準分子載體進行用限制性內切酶SalⅠ和HindⅢ進行酶切，可得到大片段的原有標準分子和小片段的OsDREB3特異擴增產物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果可見與預期片斷大小一致的目的基因片段及酶切質粒片斷(圖5).

M：DL2000；1：空白；2～3：OsDREB3.

M：DL2000；1：原有標準分子酶切結果；2：OsDREB3質粒酶切結果.

圖5原有標準分子質粒和OsDREB3質粒經

SalⅠ和HINDⅢ酶切后電泳圖

Fig.5Result of original standard molecular plasmid and

OsDREB3 plasmid with enzyme digestion

2.2.3新質粒的驗證以新構建的質粒為模板，用不同轉基因大豆特異性引物進行普通PCR擴增，擴增電泳結果如圖6所示，條帶清晰，所擴增片段大小與預期擴增片段大小一致，表明所構建的新標準分子準確、有效.

M：M：DL-2000；1：GTS40-3-2；2：lectin基因；3：A2704-12；4：A5547-127；5：OsDREB3；6：MON89788.

圖6標準分子目的片段PCR擴增

Fig.6PCR amplification of standard molecular fragment

3討論

3.1轉OsDREB3基因大豆拷貝數的確定

在新的轉基因植物研究過程中，由于外源基因隨機插入的數量影響其表達，有時甚至會造成外源基因沉默.因此拷貝數對于由于外源基因隨機插入而獲得的轉基因轉化植株的分子生物學性狀的研究非常重要.近年來,利用高通量、快速、靈敏的Real-time PCR方法檢測轉基因拷貝數逐漸受到科研人員的青睞[10-11].獲得轉基因植株外源基因拷貝數的方法很多，如Southern Blot方法就是最常用的轉基因植株外源基因拷貝數獲得方法，此外還有CGH、FISH、Micro array等方法也常用于外源基因拷貝數的分析.但是這些方法均存在許多不足，例如，對于發(fā)生基因重排的外源基因檢測不夠準確，需要的DNA模板量多、且檢測時工作量大并且費時，甚至使用放射性同位素[12-15].Askild[16]采用5’核酸酶PCR方法獲得了轉基因玉米MON810拷貝數為單拷貝，是一種新型的定量方法，較Real-time PCR方法更適合轉基因深加工制品.基于Real-time PCR方法建立起來拷貝數分析方法，具有克服以上各種弊端的優(yōu)點.研究發(fā)現,雖然在利用Southern雜交和熒光實時定量PCR這2種方法檢測轉基因拷貝數時結果十分接近，但楊力桃等試驗證實，分別采用Southern Blot方法和Real-time PCR分析方法來確定分析轉基因水稻植株中的HPT或GUS基因的拷貝數時，結果顯示定量PCR的方法對于分析轉基因拷貝數更加有效、適用[17-18].因此，本試驗選擇Real-time PCR方法來確定轉OsDREB3基因大豆的拷貝數.

本試驗在分析過程中，樣品設置3個重復以盡量減少誤差，以克服Real-time PCR反應過程中起始模板數微小的差異或是反應效率的微小變化而導致結果產生較大幅度的偏差.理論上來說，轉OsDREB3基因大豆通過Real-time PCR方法得到的基因拷貝數為1，可能更接近于客觀事實，因為只有基因重排才有可能影響拷貝數的結果.

3.2轉OsDREB3基因大豆標準分子的構建

作為轉基因產品監(jiān)管的重要技術支撐之一，核酸檢測技術已成為轉基因生物檢測的最主要和常用的方法.而不論采用基于核酸還是蛋白質的方法，在轉基因生物檢測時均必須使用標準物質(reference materials)作為陽性對照或制作標準曲線，以對轉基因產品進行準確檢測[19-20].

標準分子構建的原理是將OsDREB3基因轉化體特異序列克隆到以pMD18-T為載體的本實驗室陽性標準分子上的HINDⅢ/SalⅠ位點，以此獲得的質粒作為定性檢測轉GTS40-3-2基因大豆、轉MON89788基因大豆、轉A5547-127基因大豆、轉A2704-12基因大豆以及轉OsDREB3基因大豆的新標準分子，以此代替轉基因大豆檢測中的陽性對照樣品.

標準物質是具有一種或多種足夠穩(wěn)定、均一和確定的特性值，用于對設備進行校準、評價測量方法或為材料定值的物質和材料.國外研究機構中標準物質較多，購買標準物質不僅周期長、價格昂貴，而且在實際使用中品種不全，不能滿足國內日常檢測需求.標準分子(reference molecule)一般包含轉基因作物檢測的特異性片段及物種特異的內源標準基因片段，是一種重組質粒分子.由于其制備容易、簡便，并可通過細菌擴繁而獲得大量純度較高的DNA樣品，已開始作為標準物質應用于轉基因檢測[21].由于操作簡便、生產成本低、容易獲得高純度和高濃度 DNA樣品，且在一個標準分子中可容納多個目標序列等突出優(yōu)點，近年來，標準分子被認為是解決轉基因作物檢測標準物質缺乏的有效途徑之一，已作為新型 DNA標準物質用于轉基因作物檢測和定量分析[22-23].

陽性質控對照在轉基因產品檢測過程中發(fā)揮著監(jiān)控PCR體系工作正常與否的作用，是辨別假陰性和假陽性結果的重要依據之一.隨著轉基因檢測工作越來越廣泛，對陽性質控的需求量也越來越大.質粒標準分子作為新型陽性質控對照，以環(huán)形DNA狀態(tài)存在,可通過寄主菌株無限復制，且提取純化的方法簡便、用量少，完全能滿足檢測工作需求量[24-26].

近年來，我國有關轉基因作物標準分子的研究開展了許多，得到了許多性質穩(wěn)、效率高的轉化事件標準分子.如GTS40-3-2、MON89788、MON1445、MON531、MON810、MON863、NK603、Bt11等單個外源基因的轉基因作物標準分子[27-30]；敖金霞等[20]構建了定性檢測轉基因大豆、玉米、水稻的通用標準分子質粒；Yang[19]構建了含有9種轉基因玉米外源基因的標準分子，上述標準分子涵蓋了多數大規(guī)模商業(yè)化的轉基因作物，但尚未建立含有轉OsDREB3基因大豆轉化事件的標準分子.本試驗在目前實驗室現有的包括所有商品化轉基因大豆標準分子上又構建了OsDREB3轉化體特異事件，從而完善了現有轉基因大豆標準分子在OsDREB3抗旱基因檢測方面的不足，為我國建立轉OsDREB3基因大豆標識管理制度提供參考.

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(責任編輯李辛)

收稿日期：2014-06-30；修回日期：2014-07-16

基金項目：轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08004-002-002)；農業(yè)生物功能基因重點實驗室基金開放課題項目(NSGJ2012-08).

通信作者：劉營，女，助理研究員，博士，從事轉基因檢測技術方面的研究.E-mail:lyneau@126.com

中圖分類號：Q 78

文獻標志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)03-0061-07