口蹄疫病毒部分免疫功能肽段的合成、鑒定及免疫功能評價(jià)

龔真莉，蔣韜，祁淑蕓，陳國棟，李勇，劉艷紅

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)

開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州　730046；2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州　730046；

3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070)

口蹄疫病毒部分免疫功能肽段的合成、鑒定及免疫功能評價(jià)

龔真莉1，蔣韜1，祁淑蕓1，陳國棟2,3，李勇1，劉艷紅1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)

開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730046；2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州730046；

3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

摘要：利用微波多肽合成儀Liberty，合成O型口蹄疫病毒VP1 140～160和200～213氨基酸序列的兩條肽段，并用高壓液相色譜儀及質(zhì)譜分析儀就合成的多肽片段進(jìn)行分析純化和鑒定;將合成的多肽片段作為半抗原與載體蛋白BSA偶聯(lián)，免疫小鼠，進(jìn)行血清制備和抗體效價(jià)測定.結(jié)果表明：成功合成了口蹄疫2條免疫功能短肽，其純度均達(dá)到80%以上.半抗原成功與載體蛋白偶聯(lián)；小鼠抗血清經(jīng)過抗體效價(jià)檢測證明半抗原與載體蛋白偶聯(lián)組的抗體水平高于其余2個(gè)對照組,但是達(dá)不到免疫保護(hù)的水平.同時(shí)說明Liberty是一種操作簡單、方便，合成效率高的多肽合成儀，可高效合成研究用多肽.

關(guān)鍵詞：口蹄疫病毒；微波多肽合成;免疫功能肽段

第一作者：龔真莉(1981-)，女，碩士研究生，助理研究員，研究方向?yàn)椴《痉肿由飳W(xué).E-mail：gongzhenli@caas.cn

Characterization and evaluation of immune function

on synthesized FMDV peptides

GONG Zhen-li1,JIANG Tao1,QI Shu-yun1,CHEN Guo-dong2,3,LI Yong1,LIU Yan-hong1

(1.Key Laboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture,State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology,

Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730046，China;

2.China Agricultural Vet.Bio.Sci.and Tech.Co.,Ltd,Lanzhou 730046，China;3.College of Veterinary

Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070，China)

Abstract：Type O FMDV VP1 140～160 and 200～213 amino acid fragments were synthesized by LibertyTM automatic microwave peptide synthesizer.Two polypeptides were purified and identified by HPLC and MS.Mice were immunized by polypeptide conjugated to BSA and antibody titers were measured.The results showed that the two peptides were successfully synthesized and their purity was more than 80%.As the haptens,they were effectively conjugated with the carrier protein.Their anti-mouse serum antibody titers were higher than that of the other two negative control groups;however the antibody levels of immune animals were not up to the scope of protection.It also proved that LibertyTM was a simple,convenient and efficient peptide synthesizer which could synthesis research-grade peptides efficiently.This study supported evidence and a new method of antigen peptide synthesis to prepare for vaccine research.

Key words：FMDV；immune function of peptides；microwave pepticle synthesis

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的牛、豬、羊等多種偶蹄動(dòng)物的一種高度接觸性傳染病.由于本病傳播迅速、發(fā)病率高，往往造成大流行，而且嚴(yán)重影響國內(nèi)、國際貿(mào)易，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2],世界各國都高度重視對該病的預(yù)防和控制.目前除了發(fā)達(dá)國家外，大多數(shù)發(fā)展中國家都通過注射疫苗的辦法來控制該病的流行.傳統(tǒng)的滅活疫苗仍然是國內(nèi)外口蹄疫防治的主導(dǎo)方法，但是滅活疫苗容易引起過敏等副反應(yīng)及可能引起生物安全的問題，因此國內(nèi)外研究者近年來對新型疫苗進(jìn)行了大量的研究[3].

20世紀(jì)70年代開始，先后有基因工程亞單位疫苗、病毒載體疫苗、合成肽疫苗等.合成肽也是解析口蹄疫病毒的結(jié)果和功能的非常有用的手段.經(jīng)過長期試驗(yàn)結(jié)果表明，口蹄疫病毒最重要的抗原決定簇位于VP1上，而VP1的140～160和200～213氨基酸序列段都誘導(dǎo)病毒產(chǎn)生抗體[4].Pfaff等研究結(jié)果表明，對應(yīng)與這2個(gè)殘基區(qū)段的合成肽，與“載體”蛋白連接可提高其免疫原性，用來免疫試驗(yàn)動(dòng)物，合成肽疫苗能激發(fā)高水平的中和抗體，而且免疫動(dòng)物可耐受強(qiáng)毒攻擊.但140～160肽明顯占優(yōu)勢，代表最重要的抗原位點(diǎn).目前合成肽疫苗的研究主要集中在該位點(diǎn)所產(chǎn)生的免疫保護(hù)[5].

多肽固相合成涉及多步反應(yīng),但中心思想就是把每一個(gè)保護(hù)好的氨基酸作為建筑塊來構(gòu)建(合成)一個(gè)生物大分子—多肽.多肽合成可以簡單歸結(jié)為“縮合-洗滌-去保護(hù)-洗滌-縮合”[6].

利用本單位多肽合成儀Liberty，本研究擬合成2條多肽，分別為口蹄疫O型VP1區(qū)段的140～160區(qū)段和C末端200～213殘基區(qū)段.多肽合成后鑒定及純化肽段，為下一步試驗(yàn)動(dòng)物免疫及抗體水平評價(jià)準(zhǔn)備材料.經(jīng)過純化的多肽片段作為半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，將偶聯(lián)復(fù)合物作為抗原免疫試驗(yàn)動(dòng)物小鼠，經(jīng)過3次免疫制備抗血清，利用口蹄疫抗體檢測試劑盒評價(jià)抗體水平.

1材料與方法

1.1試驗(yàn)方法

1.1.1參考序列口蹄疫O型參照比較序列：O-TW-205-98;O-TW-257-2009;O-TW-258-2009，其序列均引自GenBank.

1.1.2氨基酸序列VPGH1：5′-STNNVRGD LQVLAQKAERTLP-3′；VPGH2：5′-RHKQRIV APAKQLL-3′

1.1.3主要試劑及試劑盒合成所需15種氨基酸、2種樹脂及其它溶劑試劑均購自吉爾生化(上海)有限公司，純度大于99%的分析純.偶聯(lián)試劑EDC及載體蛋白均為國產(chǎn)分析純.O型口蹄疫液相阻斷ELISA試劑盒(LPB-ELISA)購于蘭州獸醫(yī)研究所.

1.1.4試驗(yàn)動(dòng)物所用試驗(yàn)動(dòng)物為蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物場提供的清潔級、6～8周齡、雌性BALB/C小鼠.

1.1.5試驗(yàn)儀器合成肽所用儀器為研究級微波多肽合成儀，美國CEM公司，型號為Liberty.手動(dòng)切割所需搖床為江蘇海門其林貝爾儀器有限公司生產(chǎn)的水平搖床，型號為TS 200.高效液相色譜儀為北京萊伯泰科儀器有限公司的Labtech LC600，質(zhì)譜儀為Bruker Daltonics公司的autoflex TOF/TOF型號，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)的RE3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器.

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1合成方法建立按照順序依次打開電腦、儀器、軟件，根據(jù)所要合成的多肽創(chuàng)建相應(yīng)的序列及合適的方法.2條多肽均選擇合成量為0.05 mmol/L.

1.2.2多肽合成利用軟件的自動(dòng)計(jì)算功能，將合成所需各種試劑按要求配好，并安裝到儀器相應(yīng)的位置，檢查無誤后，點(diǎn)擊Start鍵，儀器合成開始進(jìn)行.多肽合成儀即按照“縮合-洗滌-去保護(hù)-洗滌-縮合”這一過程按照序列將相應(yīng)的氨基酸偶聯(lián)，直至最后一個(gè)氨基酸，反應(yīng)自動(dòng)結(jié)束.

1.2.3多肽的手工切割、沉淀及旋蒸儀器合成多肽后產(chǎn)品以與樹脂結(jié)合的形式被自動(dòng)轉(zhuǎn)移至原樹脂瓶，然后進(jìn)行手工切割.室溫下將裝有切割劑和結(jié)合了氨基酸的樹脂的容器放于水平搖床下?lián)u動(dòng)切割1.5 h.將切割完成的多肽溶液用冰乙醚高速離心進(jìn)行多肽沉淀，離心后管底白色固體.將沉于管底的多肽用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸，多肽經(jīng)旋蒸干燥后即得到了多肽粗產(chǎn)品，置于-20 ℃度冰箱保存.

1.2.4粗肽的純化及鑒定將合成好的粗肽溶解于H2O∶CH3CN=1∶1的溶液中進(jìn)行HPLC檢測其純度.HPLC檢測條件為：柱子C18；液體梯度：5%～60% B加A經(jīng)30 min(A：0.05% TFA加H2O；B：0.025% TFA加CH3CN)；使用檢測波長：214 nm.經(jīng)過HPLC鑒定其純度以后，對有必要再經(jīng)過純化的多肽進(jìn)行純化回收.將經(jīng)過純化回收的樣品送公司進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定.

1.2.5半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)利用碳二亞胺法(CDI)分別偶聯(lián)VPGH1，VPGH2兩條多肽和載體蛋白BSA.將2條多肽溶于0.01 mol/L,pH 7.4的PBS溶液中，濃度為9 mg/mL.400 μL VPGH1溶液中加入60 μL EDC，500 μL VPGH2溶液中加入70 μL EDC室溫磁力攪拌2 h,結(jié)束后在混合液中分別加入5 mg BSA,室溫?cái)嚢? h.4 ℃蒸餾水透析過夜，換透析液再透析4 h,-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.6試驗(yàn)動(dòng)物免疫及抗血清的制備取6～8周齡雌性BALB/C 小鼠20只,隨機(jī)分為4組,每組5只.分別用偶聯(lián)的2種多肽載體抗原和兩組對照(BSA對照組，生理鹽水對照組)進(jìn)行3次免疫:首次按每只小鼠50 μg的劑量將多肽與等體積弗氏完全佐劑混勻后,肌肉多點(diǎn)注射.間隔2周后進(jìn)行第2次免疫,使用弗氏不完全佐劑,偶聯(lián)多肽劑量為每只小鼠30μg.二免2周后用純抗原進(jìn)行脾內(nèi)加強(qiáng)免疫,劑量為每只小鼠30 μg.三免3～4 d后采血、制備血清、檢測抗體效價(jià).

1.2.7液相阻斷ELISA測抗血清免疫效價(jià)測定用O型口蹄疫液相阻斷ELISA試劑盒，分別檢測幾組小鼠的血清，評估多肽人工抗原的免疫效果.

2結(jié)果與分析

2.1HPLC鑒定結(jié)果

經(jīng)高效液相色譜鑒定，表明合成的2個(gè)肽段均得到了主要產(chǎn)物.圖1為VPGH1肽段的檢測圖譜，圖2為VPGH2的檢測圖譜.從這2個(gè)圖的主峰面積可以算出，VPGH2肽段的純度高于VPGH1，這也證明了肽段的長度越長，主產(chǎn)物的產(chǎn)率越低.VPGH1多肽的純度低于80%，故將29.430分的多肽峰進(jìn)行純化回收并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定.VPGH2肽段的純度高于90%，將15.202分出現(xiàn)的多肽峰進(jìn)行回收.

圖1　合成肽VPGH1的HPLC分析

圖2　合成肽VPGH2的HPLC分析

2.2質(zhì)譜鑒定結(jié)果

經(jīng)Bruker Daltonics公司的autoflex TOF/TOF質(zhì)譜儀鑒定VPGH1肽段(圖3)，證明經(jīng)過純化的VPGH1肽段為目的肽段.

2.3半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)結(jié)果

經(jīng)過SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示2種半抗原均成功與載體蛋白BSA偶聯(lián)(圖4).

2.4小鼠抗血清抗體效價(jià)測定結(jié)果

4組試驗(yàn)動(dòng)物，20只小鼠經(jīng)過3次免疫，部分小鼠在此期間由于自然死亡、相互撕咬等原因被淘汰.其中VPGH1組剩余4只小鼠，VPGH2組剩余3只，BSA對照組剩余5只，生理鹽水組剩余4只.通過O型口蹄疫液相阻斷ELISA 試劑盒檢測表明VPGH1組有2份血清檢測到抗體，VPGH2組中有一份血清產(chǎn)生了口蹄疫抗體，但效價(jià)均較低.對照組血清均未檢測到抗體.ELISA檢測結(jié)果如表1所示.

圖3　合成肽VPGH1片段的質(zhì)譜鑒定

1：BSA電泳條帶；2：VPGH2偶聯(lián)BSA電泳條帶；3：VPGH1偶聯(lián)BSA電泳條帶；M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn).

圖4SDS-PAGE圖

Fig.4SDS-PAGE

表1　ELISA檢測結(jié)果

3討論與結(jié)論

合成肽疫苗是一種僅含免疫決定簇組分的小肽,即用人工方法按天然蛋白質(zhì)的氨基酸順序合成保護(hù)性短肽,與載體連接后加佐劑所制成的疫苗,是最為理想的安全新型疫苗,也是目前研制預(yù)防和控制感染性疾病和惡性腫瘤的新型疫苗的主要方向之一[3,7-8].合成肽疫苗的研究最早始于口蹄疫病毒(FMDV)合成肽疫苗，主要集中在FMDV的單獨(dú)B細(xì)胞抗原表位(VPI環(huán))或與T細(xì)胞抗原表位結(jié)合而制備的合成肽疫苗研究[3,8].近年來，隨著合成肽疫苗研究的深入，越來越多口蹄疫合成肽相關(guān)產(chǎn)品已經(jīng)面世.口蹄疫合成肽疫苗近年來在我國已經(jīng)占有一定市場份額，合成肽疫苗與傳統(tǒng)滅活疫苗相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：能有效避免不良反應(yīng)的發(fā)生，深受養(yǎng)殖戶的喜愛；質(zhì)量可控，成本低，更適宜規(guī)?；a(chǎn)；在肽序列中有限位置上設(shè)置不同氨基酸，利用各種肽段的組合就能有效克服抗原的變異性.也可使用一些保守序列或多種不同保護(hù)性序列合成疫苗肽，從而使合成肽疫苗具有廣譜性；除傳統(tǒng)免疫途徑外，還可以通過鼻內(nèi)、口腔、皮膚等多種方式接種.綜上，合成肽技術(shù)不僅在口蹄疫疫苗研究中取得進(jìn)展而且已經(jīng)投入市場，獲得了不錯(cuò)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.多肽與蛋白質(zhì)藥物已經(jīng)是當(dāng)今國際市場上的一大類藥物，正逐步成為本世紀(jì)藥物發(fā)展的主流方向，我國也已將多肽藥物的研究開發(fā)列入未來的重點(diǎn)發(fā)展方向[7-8,10].因此，隨著多肽合成技術(shù)的發(fā)展，多肽合成已經(jīng)成為生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域研究重點(diǎn).

在本研究中，通過多肽合成前期準(zhǔn)備到合成方法的建立再到儀器合成，最后到多肽片段的手動(dòng)切割及沉淀，總結(jié)的注意事項(xiàng)以如下：自身保護(hù)：由于多肽合成過程中時(shí)用的試劑和溶劑絕大部分可對環(huán)境和人體造成傷害，故，合成實(shí)驗(yàn)室必須配備良好的通風(fēng)設(shè)備和防護(hù)面罩及手套.特別在多肽切割環(huán)節(jié)，TFA為強(qiáng)酸有強(qiáng)揮發(fā)性，對粘膜有破壞，試驗(yàn)時(shí)務(wù)必戴好防護(hù)口罩；在建立合成方法之前，仔細(xì)研究序列特征，對難以合成的部分氨基酸采用雙偶聯(lián)或提高耦合溫度等辦法，提高合成效率；氨基酸序列越長，難合成氨基酸數(shù)量越多，合成效率越低；為了節(jié)約試劑，可先進(jìn)行小量合成，根據(jù)合成效率優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后再增加合成量；合成過程中產(chǎn)生的廢液應(yīng)集中、專人處理，不可隨意傾倒至下水系統(tǒng)；合成好的粗肽旋蒸成為粉末后，可在-20 ℃冰箱長期保存，用之前溶解使用.

近年來，有研究報(bào)道，用具有性質(zhì)穩(wěn)定、不干擾偶聯(lián)分子、廉價(jià)易得等特點(diǎn)的蛋白作為載體，偶聯(lián)半抗原制備人工抗原，能夠表現(xiàn)出能增加半抗原的免疫原性，從而使產(chǎn)生征對半抗原的特異性抗體可能性增加，被廣泛應(yīng)用[9,11-12].常用來作為合成工抗原的載體蛋白質(zhì)有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚賴氨酸(PLL)等.牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HAS)分子中含有大量的賴氨酸，故有許多自由氨基存在，且在不同pH和離子強(qiáng)度下能保持較大的溶解度.此外，這些蛋白質(zhì)在用有機(jī)溶劑(如吡啶、二甲基甲酰胺)溶解時(shí)，其活性基團(tuán)仍呈可溶狀態(tài)，因此，這2種蛋白質(zhì)是最常用的載體蛋白質(zhì)[13-14].本試驗(yàn)選用碳二亞胺法偶聯(lián)多肽半抗原與BSA，該連接方法操作簡單、作用時(shí)間短、偶聯(lián)效果好，結(jié)果表明兩段半抗原均成功與載體蛋白偶聯(lián).

試驗(yàn)通過免疫試驗(yàn)動(dòng)物及抗體水平評價(jià)，結(jié)果表明：含2段多肽片段的人工抗原均有一定水平的抗體產(chǎn)生，但效價(jià)很低.這與半抗原的長度較短、空間結(jié)構(gòu)單一，沒有形成有效的空間構(gòu)象等因素有關(guān).口蹄疫病毒具有免疫原性的抗原位點(diǎn)都是構(gòu)象位點(diǎn),而短的合成肽段很難在體內(nèi)形成有效的構(gòu)象.其中的原因有很多，如：肽段短而易被迅速地排出體外，也可能缺少強(qiáng)的和適宜的輔助T細(xì)胞表位.目前研究者采用許多方法改善短肽抗原的免疫原性，最簡單的辦法就是增加肽段的長度和以化學(xué)方法使合成肽與某種大的載體蛋白結(jié)合，取得了不錯(cuò)的效果.目前市面上的多肽疫苗均同時(shí)包括這兩條短肽，并進(jìn)行了一些結(jié)構(gòu)的修飾，使其空間構(gòu)象與病毒顆粒上的天然位點(diǎn)相似，所以具有不錯(cuò)的免疫效果.而此試驗(yàn)作為多肽合成及疫苗研制等基礎(chǔ)性研究，證明了這2條肽段有一定的免疫原性，為后期的改造和再研究提供了數(shù)據(jù)支持，已經(jīng)達(dá)到實(shí)驗(yàn)的預(yù)期結(jié)果.

本試驗(yàn)利用微波多肽合成儀Liberty，通過篩選最具代表性和被國內(nèi)外認(rèn)可的口蹄疫免疫功能區(qū)的氨基酸片段，多次優(yōu)化試驗(yàn)條件成功合成2條多肽.利用碳二亞胺法成功將2條合成的多肽與載體蛋白BSA偶聯(lián)，得到2種人工合成抗原.人工合成抗原經(jīng)過3次免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠，獲得抗血清，抗血清經(jīng)檢測部分產(chǎn)生O型口蹄疫抗體，與對照組差異顯著.

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(責(zé)任編輯李辛)

收稿日期：2014-04-14；修回日期：2014-05-07

基金項(xiàng)目：甘肅省科技重大專項(xiàng)計(jì)劃(1002NKDA039).

通信作者：劉艷紅，女，博士，研究員，研究方向?yàn)椴《痉肿由飳W(xué).E-mail：liuyanhong@caas.cn

中圖分類號：Q 516

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)03-0035-05