蘇子油對瘤胃體外發(fā)酵模式、脂肪酸組成及甲烷生成的影響

史浩亭，王加啟，卜登攀，潘龍，李發(fā)弟

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州　730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，

動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京　100193)

蘇子油對瘤胃體外發(fā)酵模式、脂肪酸組成及甲烷生成的影響

史浩亭1，2，王加啟1，2，卜登攀2，潘龍2，李發(fā)弟1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，

動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193)

摘要：為探討蘇子油對瘤胃體外發(fā)酵的影響,采用人工瘤胃技術分析不同添加水平的蘇子油對瘤胃發(fā)酵模式、發(fā)酵參數(shù)和瘤胃脂肪酸代謝的影響.結(jié)果表明：添加不同劑量蘇子油對發(fā)酵液pH值和氨氮(NH3-N)含量無顯著影響(P>0.05)；與對照相比較，隨著蘇子油添加量的增加干物質(zhì)降解率、中性洗滌纖維降解率、酸性洗滌纖維降解率、發(fā)酵底物單位產(chǎn)氣量顯著降低(P<0.05)，甲烷產(chǎn)量呈下降趨勢(P>0.05)；對TVFA無顯著影響(P>0.05)，丙酸含量顯著增加(P<0.05)，乙酸含量和乙酸丙酸比例顯著降低(P<0.05)；C18：1、c9，t11-CLA和總的長鏈脂肪酸濃度均明顯升高(P<0.01).表明在糧中添加一定量的蘇子油,可改變瘤胃發(fā)酵類型、降低甲烷產(chǎn)量、調(diào)節(jié)瘤胃液脂肪酸組成.

關鍵詞：蘇子油；人工瘤胃裝置；CH4產(chǎn)量；氫化

第一作者：史浩亭(1987- )，男，碩士研究生，從事反芻動物營養(yǎng)與牛奶質(zhì)量改良研究.E-mail：sht444@126.com

卜登攀，男，副研究員，碩士生導師，主要從事反芻動物營養(yǎng)代謝與調(diào)控、牛奶品質(zhì)改善和瘤胃微生態(tài)研究與應用方面的研究.E-mail:burdenpan@gmail.com

Effects of perilla seed oil supplements on rumen fermentation

parameters,fatty acid composition and methane

production by a rumen-simulation technique

SHI Hao-ting1,2,WANG Jia-qi1,2,BU Deng-pan2,PAN Long2,LI Fa-di1

(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;

2.State Key Laboratory of Animal Nutrition,Institute of Animal Science,Chinese

Academy of Agricultural Science,Beijing 100193,China)

Abstract：In order to investigate the effects of perilla oil on rumen fermentation in vitro,we analyzed the change trend of rumen fermentation model,parameters and fatty acid metabolism in different levels of perilla oil based on artificial rumen fermentation.The results indicated that different doses of perilla oil had no significant effect on the pH and ammonia (NH3-N) content of fermentation broth (P>0.05).Compared with control,the degradation rate of dry matter,neutral detergent fiber,acid detergent fiber and gas production of fermentable substrates significantly decreased with perilla oil dose increase (P<0.05).Meanwhile,the content of propionic acid,acetic acid and acetate propionate proportion significantly decreased (P<0.05) while the effect of perilla oil on TVFA was insignificant (P>0.05).Methane production treated by different doses of perilla oil had a downside(P>0.05)while the concentration of C18∶1,c9,t11-CLA and total long chain fatty acids significantly increased (P<0.01).It is suggested that adding an appropriate dose of perilla soil in diet could change rumen fermentation type,reduce methane production and regulate the fatty acid composition of rumen fluid.

Key words：perilla seed oil；artificial rumen device;methane production;biohydrogenation

在反芻動物瘤胃“宿主-微生物”共生體系中，微生物發(fā)酵伴隨著能量和氮的損失且釋出大量的甲烷造成環(huán)境污染[1].研究表明,通過日糧、化學物質(zhì)、生物學方法以及植物提取物等可調(diào)控瘤胃微生物發(fā)酵[2]，而提高瘤胃發(fā)酵效率、降低甲烷排放、提高動物生產(chǎn)性能.但一些化學制劑在動物組織和畜產(chǎn)品中的殘留量對人體健康產(chǎn)生危害[3]，因此開發(fā)天然的瘤胃調(diào)控劑具有重要的意義.

從自然界植物果實、種子、胚芽等中提取的含有不飽和脂肪酸的植物油具有調(diào)控反芻動物瘤胃發(fā)酵、改善其產(chǎn)品中的脂肪酸組成和有抑制甲烷的效果[4]，且能調(diào)控瘤胃脂肪酸的代謝，受到人們廣泛關注，但添加大量植物油往往會影響瘤胃本身的消化代謝[5].紫蘇油是紫蘇籽粒經(jīng)預處理并通過特定方法提取得到的可食用油[6].研究表明，紫蘇油中含豐富的油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸，其中α-亞麻酸含量可達50%以上[7]，是目前發(fā)現(xiàn)含α-亞麻酸最高的植物油[8]，其通過瘤胃微生物氫化過程產(chǎn)生的中間產(chǎn)物可為反芻動物合成CLA提供底物.本試驗擬研究添加不同水平的蘇子油對體外瘤胃發(fā)酵、甲烷產(chǎn)量以及脂肪酸組成的影響,以期為豐富和發(fā)展天然反芻動物瘤胃調(diào)控劑提供依據(jù).

1材料與方法

1.1供體動物及瘤胃液的采集

在北京中地種畜有限公司試驗基地選取3頭健康且裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛(體質(zhì)量=(558±10)kg， 泌乳日齡=(136±37)d，胎次3)作為瘤胃液供體牛.奶牛每天飼喂3次(7∶00，13∶00和19∶00)，自由飲水.在晨飼2 h后通過瘤胃瘺管采集瘤胃內(nèi)容物并裝入保溫瓶迅速帶回實驗室，用4層紗布過濾(過濾同時通入CO2)，整個操作在盡量短的時間內(nèi)于39 ℃水浴中完成.

1.2蘇子油和飼料樣品制備

發(fā)酵所用飼料與供體動物所飼喂的飼料一致，飼料原料粉碎并過2 mm篩，按配方制成顆粒料，風干后備用，飼料組成及營養(yǎng)成分見表1.蘇子油來自于甘肅省天水地區(qū)的紫蘇通過傳統(tǒng)的壓榨工藝榨取獲得，主要成份見表2.

表1　日糧組成和營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

①每kg預混料(DM)含有VA 2 000 000 IU、VD 600 000 IU、VE 10 800 mg、Fe 5 500 mg、Cu 4 080 mg、Mn 4 989 mg、Zn 17 500 mg、I 180 mg、Se 110 mg和Co 8 805 mg.②NEL為計算值，其他為實測值.

1.3試驗設計

采用完全隨機設計，以0%添加為對照，蘇子油的添加量為飼料干物質(zhì)含量的1%、2%、3%和4%.試驗期8 d(前5 d的適應期，后3 d采樣期)，試驗重復3次.

1.4體外發(fā)酵

人工瘤胃裝置使用中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所反芻動物營養(yǎng)研究室研制的“固液氣分流式瘤胃模擬系統(tǒng)”[9].試驗開始時每個發(fā)酵罐(有效體積1 L)中加入20 gTMR、500 mL新鮮瘤胃液和500 mL人工唾液進行發(fā)酵，人工唾液采用Dougall等[10]設計的配方配制且每升加入0.4 g尿素，以模仿瘤胃氮循環(huán)[11].試驗時裝置運行參數(shù)為：水浴溫度39 ℃;攪拌轉(zhuǎn)速15 r/min;液體稀釋率8%/h[12];固體稀釋率4% /h.每天早、晚九點定時每個發(fā)酵罐排出100 mL食糜，加入20 g TMR(補料)和100 mL人工唾液，同時加入相應添加水平的蘇子油.

1.5樣品采集

每天(整個試驗期)補料前從發(fā)酵罐底部的排固口和溢流液中收集消化后過篩網(wǎng)的食糜于尼龍袋中，通過清洗烘干用于食糜的干物質(zhì)(DM)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的測定.裝置內(nèi)瘤胃微生物發(fā)酵在補料3 h后基本處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，因此，在采樣期(第6～8天)的每天9∶00補料后3 h時采集10 mL發(fā)酵液用于VFA、脂肪酸濃度的測定，在3、6、9、12 h均采集發(fā)酵液4 mL用于NH3-N濃度、pH的測定，以研究瘤胃微生物對不同劑量蘇子油的適應情況.采樣期每個發(fā)酵罐外接1個氣袋收集9∶00補料后12 h內(nèi)發(fā)酵所產(chǎn)生的氣體，用于CH4體積分數(shù)的測定.

1.6樣本分析

發(fā)酵液pH通過取樣用pH計(Sartorius,PB-10)測定,揮發(fā)性脂肪酸、脂肪酸濃度和氣體中CH4體積分數(shù)在前處理后用氣相色譜( Agilent-6890 NGC system，Agilent，America)測定[13].用靛酚比色法測定發(fā)酵液中NH3-N濃度[14].NDF和ADF含量按照Van Soest等[15]的方法測定.DM含量參照GB 6435-86測定.

1.7數(shù)據(jù)處理

試驗各項指標的數(shù)據(jù)用Excel 2010進行初步整理后，采用SAS 9.1中ANOVA模型進行方差分析，并采用Ducan氏法進行多重比較.

2結(jié)果與分析

2.1蘇子油添加水平對瘤胃微生物發(fā)酵參數(shù)的影響

從表3可知，添加蘇子油后未對各組發(fā)酵液pH值、 NH3-N濃度產(chǎn)生顯著影響(P>0.05).隨著添加劑量的升高干物質(zhì)體外降解率(IVDMD)、中性洗滌纖維降解率(DNDF)、酸性洗滌纖維降解率(DADF)和飼料的單位產(chǎn)氣量均顯著降低(P<0.05).甲烷含量隨著添加劑量的增加呈下降趨勢，最大劑量與對照組比較甲烷含量降低了24%.

表3　蘇子油添加水平對瘤胃微生物發(fā)酵參數(shù)的影響

同列肩標不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05).

2.2蘇子油添加水平對VFA濃度的影響

由表4可知，添加不同水平的蘇子油對未發(fā)酵液中總VFA、丁酸、戊酸和支鏈揮發(fā)性脂肪酸濃度產(chǎn)生顯著影響(P>0.05).與對照組相比，隨著添加劑量的增加，乙酸和乙酸/丙酸值呈下降趨勢，丙酸呈升高趨勢；添加2%蘇子油對乙酸濃度及乙酸/丙酸有顯著影響(P<0.01)乙酸；添加3%和4%的蘇子油對乙酸、丙酸、乙酸/丙酸值的影響結(jié)果保持一致，之間比較無顯著變化(P>0.05).

表4　蘇子油添加水平對揮發(fā)性脂肪酸的影響

同列肩標不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05).

2.3蘇子油添加水平對脂肪酸濃度的影響

由表5可知，添加蘇子油未對C8∶0-C18∶0等脂肪酸產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，隨著添加劑量的增加,油酸、亞油酸和亞麻酸含量呈上升趨勢，其中.與對照相比，在3%添加水平時總脂肪酸含量、不飽和脂肪酸含量，多不飽和脂肪酸影響效果顯著(P<0.05).

表5　蘇子油添加水平對瘤胃液中脂肪酸的影響

同列肩標不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05).

3討論與結(jié)論

3.1蘇子油不同添加水平對瘤胃微生物發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃液pH是綜合反映瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要指標，可以反映瘤胃內(nèi)部的環(huán)境狀況及飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵程度和模式[16]，本試驗中添加蘇子油未對發(fā)酵液pH產(chǎn)生顯著影響(P=0.66).瘤胃中NH3-N能間接反映瘤胃微生物分解飼料粗蛋白產(chǎn)生NH3-N和利用NH3-N合成微生物菌體蛋白的平衡情況，符合其生長的最適NH3-N濃度范圍5～28 mg/dL[17]，本研究NH3-N濃度在適宜范圍內(nèi)且添加蘇子油未對其含量有顯著影響.添加植物油可提高日糧能量濃度，但過量時會影響日糧的消化，本試驗中干物質(zhì)降解率、中性、酸性洗滌纖維降解率都隨著添加劑量的提高而降低，說明添加蘇子在一定量時可抑制飼料的發(fā)酵，使其降解率下降.添加蘇子油也抑制了甲烷的產(chǎn)量和單位干物質(zhì)的產(chǎn)氣量其主要作用途徑是調(diào)控不飽和脂肪酸的氫化作用，使瘤胃內(nèi)丙酸產(chǎn)量增加，并抑制瘤胃微生物生長.

3.2蘇子油不同添加水平對VFA濃度的影響

VFA是碳水化合物在瘤胃中發(fā)酵的主要產(chǎn)物，可提供反芻動物總能量需要量的70%～80%，其含量及組成比例是反映瘤胃消化代謝活動的重要指標.乙酸、丙酸、丁酸是VFA的主要成分其濃度受到反芻動物采食水平、日糧組成以及pH等因素的影響.本試驗中發(fā)酵底物是相同的，添加蘇子油對總VFA濃度未產(chǎn)生顯著影響，但對乙酸和丙酸濃度影響顯著，降低了乙丙酸比值，使發(fā)酵模式傾向于丙酸型，與報道中添加其他不飽和脂肪酸植物油影響瘤胃發(fā)酵模式的結(jié)果基本一致[18-19].可能原因是隨著添加蘇子油量的增加，抑制了瘤胃發(fā)酵和纖維素的降解，改變了微生物活動或微生物酶活性造成的.

3.3蘇子油不同添加水平對長鏈脂肪酸的影響

日糧中不飽和脂肪酸進入瘤胃后可被微生物分解、氫化(biohydrogenation),最終生成硬脂酸(C18∶0)[20],氫化過程中會產(chǎn)生多種中間產(chǎn)物如C18∶1和CLA等異構(gòu)體[21]，其中trans11-C18∶1加氫生成C18∶0是生物氫化過程的限速步驟[22].研究發(fā)現(xiàn)增加飼糧亞油酸和(或)亞麻酸的水平，可抑制trans11C18∶1進一步氫化成C18∶0，能提高乳脂cis-9,trans11CLA的含量[23].驗結(jié)果表明，隨著蘇子油量增加，C18∶0的含量呈上高趨勢，蘇子油的添加水平在3%時，C18∶1和c9,t11-CLA的含量顯著增加，C18∶2和C18∶3的含量也顯著增加.而在各種酸的增加幅度上,以c9-C18∶1和t11-C18∶1最為明顯,在一定程度上說明通過添加蘇子油增加C18∶1的含量可進一步提高組織中CLA量.

本試驗結(jié)果也表明，日糧添加3%蘇子油使發(fā)酵液中脂肪酸總量(TFA)增加的同時,不飽和脂肪酸(UFA)含量也顯著升高,其中單不飽和脂肪酸(MUFA)相對于對照組增加了23.6%.而蘇子油中90%以上為不飽和脂肪酸,說明蘇子油對瘤胃脂質(zhì)的生物氫化模式有一定影響.

本試驗添加不同水平的蘇子油對瘤胃發(fā)酵參數(shù)、脂肪酸代謝產(chǎn)生了影響，隨添加水平的提高，產(chǎn)氣量及甲烷產(chǎn)量逐漸降低；瘤胃液pH值逐漸升高；干物質(zhì)降解率，纖維降解率逐漸降低；乙酸摩爾濃度降低，丙酸摩爾濃度呈上升趨勢，乙酸丙酸比下降，從以上幾個指標得出，不同添加水平蘇子油對瘤胃代謝影響程度，添加水平越大，對抑制產(chǎn)氣及甲烷產(chǎn)量有積極作用，但同時對纖維降解有不利的影響，對發(fā)酵類型也有顯著影響.綜合各項指標，本次體外試驗中，蘇子油的最適添加量為3%.

參考文獻

[1]Boadi D,Benchaar C,Chiquette J,et al.Mitigation strategies to reduce enteric methane emissions from dairy cows:Update review[J].Canadian Journal of Animal Science， 2004,84(3):319-335

[2]Tekippe J A,Hristov A N,Heyler K S,et al.Effects of plants and essential oils on ruminal in vitro batch culture methane production and fermentation[J].Canadian Journal of Animal Science，2012,92(3):395-408

[3]張春梅.植物油及十八碳不飽和脂肪酸對瘤胃甲烷生成和微生態(tài)的影響[D].杭州： 浙江大學,2008

[4]Johnson K A,Johnson D E.Methane emissions from cattle[J].Journal of Animal Science，1995,73(8):2483-2492

[5]王喜樂，沈向真，楊俊花，等.添喂葵花籽油對山羊瘤胃消化代謝與瘤胃液脂肪酸組成的影響[J].畜牧獸醫(yī)學報，2007(4):356-361

[6]李曉鵬.紫蘇籽粒主要營養(yǎng)成分的提取與分離[D].中北大學,2013

[7]李會珍，劉艷，李曉君，等.不同品種紫蘇種子營養(yǎng)成分及脂肪酸組分分析[J].中國農(nóng)學通報，2014，30(3):276-280

[8]Nitta M,Kobayashi H,Ohnishi-Kameyama M,et al.Essential oil variation of cultivated and wild Perilla analyzed by GC/MS[J].Biochemical Systematics and Ecology，2006,34(1):25-37

[9]沈維軍，姜雅慧，王加啟，等.固液氣分流式瘤胃模擬系統(tǒng)的設計與測試[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2012,28(3):20-26

[10]Mcdougall E I.Studies on ruminant saliva.Ⅰ： The composition and output of sheep's saliva[J].Biochemical Journal，1948,43(1):99

[11]金恩望，卜登攀，王加啟，等.利用雙外流持續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)研究植物精油對瘤胃發(fā)酵和甲烷生成的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2013，25(10):2303-2314

[12]包萬華，王加啟，卜登攀，等.稀釋率對新型固液氣分流式瘤胃模擬系統(tǒng)發(fā)酵效果的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2013，25(7):1534-1540

[13]王聰，周凌云，李發(fā)弟，等.日糧中不同蒙脫石添加量對奶牛瘤胃發(fā)酵及糞便發(fā)酵的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2013,48(5):24-31

[14]姜艷美，王加啟，鄧露芳，等.酵母菌培養(yǎng)物對瘤胃發(fā)酵的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2008，23(1):92-97

[15]Van Soest P V,Robertson J B,Lewis B A.Methods for dietary fiber,neutral detergent fiber,and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition[J].Journal of Dairy Science，1991,74(10):3583-3597

[16]徐振松，瞿明仁，宋小珍，等.不同水平廣藿香精油對錦江黃牛瘤胃體外發(fā)酵指標及養(yǎng)分降解率的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2013，25(11):2748-2754

[17]Wanapat M,Pimpa O.Effect of ruminal NH3-N levels on ruminal fermentation,purine derivatives,digestibility and rice straw intake in swamp buffaloes[J].Asian Australasian Journal of Animal Sciences,1999,12:904-907

[18]Machmüller A,Ossowski D A,Kreuzer M.Comparative evaluation of the effects of coconut oil,oilseeds and crystalline fat on methane release,digestion and energy balance in lambs[J].Animal Feed Science and Technology,2000,85(1):41-60

[19]Bateman I H G,Jenkins T C.Influence of soybean oil in high fiber diets fed to nonlactating cows on ruminal unsaturated fatty acids and nutrient digestibility[J].Journal of Dairy Science,1998,81(9):2451-2458

[20]Griinari J M,Bauman D E.Biosynthesis of conjugated linoleic acid and its incorporation into meat and milk in ruminants[J].Advances in Conjugated Linoleic Acid Research,1999,1(1)

[21]Wahle K W,Heys S D,Rotondo D.Conjugated linoleic acids:are they beneficial or detrimental to health?[J].Progress in Lipid Research,2004,43(6):553-587

[22]馮志華，高艷霞，李秋鳳，等.奶牛脂肪營養(yǎng)研究進展[J].動物營養(yǎng)學報,2013(06):1137-1143

[23]Lock A L,Garnsworthy P C.Independent effects of dietary linoleic and linolenic fatty acids on the conjugated linoleic acid content of cows' milk[J].Animal Science,2002,74:163-176

(責任編輯李辛)

收稿日期：2014-04-17；修回日期：2014-04-25

基金項目：中國科學院知識創(chuàng)新工程重要方向項目(XDA01010301)；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS07)；“十二五”科技支撐計劃課題(2012BAD43B01-2).

通信作者：王加啟，男，博士，研究員，博士生導師，從事反芻動物營養(yǎng)與牛奶質(zhì)量安全研究.E-mail:wang-jia-qi@263.net

中圖分類號：S 816.7

文獻標志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)02-0023-06