RAGE/NF-κB信號通路調(diào)控溶血卵磷脂誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1表達(dá)*

喻日成，羅建華，范元碩，劉 波

(貴州省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州貴陽 55000)

?

RAGE/NF-κB信號通路調(diào)控溶血卵磷脂誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1表達(dá)*

喻日成，羅建華△，范元碩，劉 波

(貴州省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州貴陽 55000)

目的 探討糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)/核因子κB(NF-κB)信號通路在調(diào)控溶血卵磷脂(LPC)誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(HERCs)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)表達(dá)中的作用。方法 利用RAGEsiRNA及NF-κB抑制劑作用RAGE/NF-κB信號通路，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)及Westernblot檢測RAGE及TGF-β1基因表達(dá)。結(jié)果LPC能增加HERCs的RAGE、TGF-β1基因表達(dá)，RAGE基因沉默后能抑制LPC誘導(dǎo)的RAGE、TGF-β1的表達(dá)。加入NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)能顯著減少LPC誘導(dǎo)的RAGE、TGF-β1基因表達(dá)。結(jié)論RAGE/NF-κB信號通路在調(diào)控LPC誘導(dǎo)的HERCs表達(dá)TGF-β1中起重要作用。

溶血磷脂酰膽堿類；糖基化終產(chǎn)物受體；人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子β1

糖尿病視網(wǎng)膜病變是視網(wǎng)膜微血管的一種進(jìn)行性病變，主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管通透性增加、管腔閉塞、新生血管形成[1]。晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)及AGE受體(receptor for AGE，RAGE)的相互作用在糖尿病血管并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用[2]。AGEs通過RAGE激活核因子κB(NF-κB)及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，而NF-κB的激活能增加視網(wǎng)膜微血管氧化應(yīng)激及多種細(xì)胞因子[如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1)]的釋放，參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展[3]。溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine，LPC)是氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)的主要成分，與人類多種疾病如動脈粥樣硬化、糖尿病及惡性腫瘤密切相關(guān)[4]。目前LPC在糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變中的作用機(jī)制還不清楚，本研究通過RNA干擾及NF-κB抑制劑，探討RAGE/NF-κB信號通路在調(diào)控人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal endothelial cells，HRECs)分泌TGF-β1中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：LPC購自Sigma公司；低糖改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培基及胎牛血清購自Giboco公司；HRECs購自ScienCell公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Biosystems公司；RAGE抗體購自BD Biosciences公司；TGF-β1、β-actin抗體及辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的二抗購自Santa Cruz公司；HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑盒購自QIAGEN公司；LightCycler?TaqMan?Master購自Roche公司；NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)購自Sigma公司；

1.2 方法

1.2.1 RAGE-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞 HRECs在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞前，HRECs種植在6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約2.5×105個(gè)，待細(xì)胞生長至80%左右開始轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。在6孔板的每孔中加入300 ng的RAGE siRNA稀釋于100 μL無血清培養(yǎng)基中，再加入18 μL HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑室溫下共同孵育10 min，將轉(zhuǎn)染混合物加入到含有700 μL無血清培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)3 h之后，加入1 600 μL含有10%FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 (1)RAGE siRNA作用HRECs：分為對照siRNA組、LPC+RAGE siRNA組、LPC+對照siRNA組、RAGE siRNA組，LPC 的濃度為40 μmol。(2)PDTC作用HRECs：分為對照組、LPC組、LPC+PDTC組，LPC 的濃度為40 μmol。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測RAGE、TGF-β1mRNA表達(dá) RT-qPCR檢測以GAPDH為內(nèi)參照，按Trizol試劑盒說明書介紹的方法提取總RNA，采用Nanodrop ND1000 測量RNA水平。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，總反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：25 ℃10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，冷卻至4 ℃后取出-20 ℃保存。PCR擴(kuò)增：cDNA模板2 μL，TaqMan?Master 5 μL，雙蒸水(ddH2O)2.5 μL，引物0.5 μL。RAGE上游引物:5′-AGC TTC AGT CTG GGC CTT C-3′,下游引物:5′-CAG CTG AAT GCC CTC TGG-3′;TGF-β1上游引物:5′-TGA ACC AAG GAG ACG GAA TAC AGG-3,下游引物:5′-GCC ATG AGG AGC AGG AAG GG-3′;GAPDH上游引物:5′-CAA TGA CCC CTT CAT TGA CC-3′,下游引物:5′-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3′。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃10 min(1個(gè)循環(huán))，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 20 s (45個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5 min(1 循環(huán))。每個(gè)qPCR重復(fù)3次，目的基因mRNA的相對表達(dá)量通過公式2-△△Ct計(jì)算。

1.2.4 Western blot檢測RAGE、TGF-β1蛋白表達(dá)水平 Western blot檢測以β-actin為內(nèi)參照。收集處理的細(xì)胞，用冰磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗3次，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，通過二辛可寧酸(BCA)方法測量蛋白水平。將30 μg的蛋白樣品加入10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)點(diǎn)樣孔，100 V電壓電泳2 h。轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%的脫脂牛奶封閉，分別加RAGE、TGF-β1、β-actin一抗4 ℃過夜，Tris緩沖生理鹽水吐溫(TBST)洗3次，HRP標(biāo)記的二抗常溫下30 min，TBST洗3次?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影、定影，將膠片進(jìn)行掃描拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

2 結(jié) 果

2.1RAGEsiRNA下調(diào)RAGE、TGF-β1基因表達(dá)HRECs轉(zhuǎn)染RAGEsiRNA和對照siRNA后通過RT-qPCR及Westernblot檢測RAGE、TGF-β1基因的表達(dá)，與對照siRNA組比較，LPC+對照siRNA組RAGE及TGF-β1基因表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，RAGEsiRNA組RAGE及TGF-β1基因表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；LPC+對照siRNA組與LPC+RAGEsiRNA組比較，RAGE及TGF-β1基因表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖1。

1：LPC+RAGEsiRNA組；2：LPC+對照siRNA組；3：RAGEsiRNA組；4：對照siRNA組；a：P<0.05，與LPC+對照siRNA組比較；b：P<0.05，與對照siRNA組比較。

圖1RAGEsiRNA對HRECsTGF-β1、

RAGE基因表達(dá)的影響

2.2PDTC下調(diào)RAGE、TGF-β1基因表達(dá)HRECs加入PDTC后通過RT-qPCR及WesternBlot檢測RAGE、TGF-β1基因的表達(dá)，結(jié)果顯示：LPC作用HRECs后RAGE、TGF-β1基因表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與LPC組比較，LPC+PDTC組RAGE、TGF-β1基因表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖2。

1：LPC+PDTC組；2：LPC組；3：對照組；a：P<0.05，與LPC+PDTC組比較。

圖2PDTC對HRECsTGF-β1、RAGE基因表達(dá)的影響

3 討 論

Ox-LDL中的主要成分LPC與多種疾病如動脈粥樣硬化、糖尿病慢性并發(fā)癥、哮喘等關(guān)系密切[4-5]。Ox-LDL所致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是糖尿病慢些并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[6]。LPC作為Ox-LDL中一種促炎癥顆粒能啟動細(xì)胞內(nèi)一系列的信號傳導(dǎo)通路，與慢性低度炎癥性疾病密切相關(guān)[7]。LPC能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，使白細(xì)胞浸潤至內(nèi)皮細(xì)胞下，啟動血管的炎癥反應(yīng)[8]。Yu等[9]研究表明，Ox-LDL導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與高遷移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox1，HMGB1)的釋放有關(guān)。HMGB1與RAGE結(jié)合激活NF-κB，上調(diào)炎癥分子的表達(dá)。Ox-LDL/HMGB1-RAGE/NF-κB組成的信號通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞的慢些炎癥中起重要作用[10]。糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病的一種常見慢性并發(fā)癥，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂在其中起重要作用。脂質(zhì)能不依賴高血糖導(dǎo)致血管的損傷，特別是Ox-LDL能通過增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生刺激炎癥反應(yīng)及纖維形成[11]。

本研究表明，LPC作用于HRECs后，RAGE及TGF-β1的表達(dá)明顯上調(diào)。RAGE是一種能與多種配體結(jié)合的受體，如AGEs、HMGB1，RAGE與配體結(jié)合后可激活NF-κB通路，上調(diào)一系列的血管活性因子的表達(dá)[12]。而血管活性因子TGF-β1的升高與糖尿病微血管慢性并發(fā)癥密切相關(guān)[13]。因此，本研究推測LPC作用HRECs所致的TGF-β1上調(diào)與RAGE的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。為了證實(shí)其推測，本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默RAGE基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAGE基因沉默后，LPC誘導(dǎo)的TGF-β1的表達(dá)明顯下調(diào)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPC誘導(dǎo)的HRECs表達(dá)TGF-β1的上調(diào)部分是通過RAGE起作用。

RAGE與配體結(jié)合后激活NF-κB，活化的NF-κB作為一種正反饋，又可進(jìn)一步促進(jìn)RAGE與配體結(jié)合，二者構(gòu)成級聯(lián)反應(yīng)造成細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變和損傷，促進(jìn)細(xì)胞因子和組織因子的釋放[14]。RAGE通過NF-κB途徑促進(jìn)氧化應(yīng)激及促炎因子的釋放加重血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害[15]。為了闡明NF-κB對LPC誘導(dǎo)的HRECs表達(dá)TGF-β1及RAGE的影響，本研究用NF-κB抑制劑PDTC作用細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入PDTC后，HRECs表達(dá)RAGE及TGF-β1明顯下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，NF-κB參與了LPC誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)調(diào)控。

本研究結(jié)果表明，RAGE/NF-κB信號通路在調(diào)控LPC誘導(dǎo)的HRECs表達(dá)TGF-β1中起重要作用。RAGE與NF-κB相互作用產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)參與了脂代謝紊亂所致的糖尿病視網(wǎng)膜病變。

[1]IshibashiT.Cellbiologyofintraocularvasculardiseases[J].JpnJOphthalmol,2000,44(3):323-324.

[2]HanD,YamamotoY,MunesueS,etal.Inductionofreceptorforadvancedglycationendproductsbyinsufficientleptinactiontriggerspancreaticβ-cellfailureintype2diabetes[J].GenesCells,2013,18(4):302-314.

[3]BucciarelliLG,WendtT,QuW,etal.RAGEblockadestabilizesestablishedather-osclerosisindiabeticapolipoproteinE-nullmice[J].Circulation,2002,106(22):2827-2835.

[4]ChisolmGM,SteinbergD.Theoxidativemodificationhypothesisofatheroge-nesis:anoverview[J].FreeRadicBiolMed,2000,28(12):1815-1826.

[5]MatsumotoT,KobayashiT,KamataK.Roleoflysophosphatidylcholine(LPC)inatherosclerosis[J].CurrMedChem,2007,14(30):3209-3220.

[6]CinesDB,PollakES,BuckCA,etal.Endothelialcellsinphysiologyandinthepathophysiologyofvasculardisorders[J].Blood,1998,91(10):3527-3561.

[7]MurugesanG,SandhyaRaniMR,GerberCE,etal.Lysophosphatidylcholineregulateshumanmicrovascularendothelialcellexpressionofchemokines[J].JMolCellCardiol,2003,35(11):1375-1384.

[8]ShiY,ZhangP,ZhangL,etal.Roleoflipoprotein-associatedphospholipaseA2inleukocyteactivationandinflammatoryresponses[J].Atherosclerosis,2007，191(1):54-62.

[9]YuX,XingC,PanY,etal.IGF-1alleviatesox-LDL-inducedinflammationviareducingHMGB1releaseinHAECs[J].ActaBiochimBiophysSin,2012,44(9):746-751.

[10]LuanZG,ZhangH,YangPT,etal.HMGB1activatesnuclearfactor-κBsignalingbyRAGEandincreasestheproductionofTNF-αinhumanumbilicalveinendothelialcells[J].Immunobiology,2010,215(12):956-962.

[11]KenneWF.Theroleoflipidsinrenaldiseasefuturechallenges[J].KidneyInt,2000,57Suppl1:S27-31.

[12]VanGeestRJ,KlaassenI,Lesnik-ObersteinSY,etal.VitreousTIMP-1levelsassociatewithneovascularizationandTGF-β2levelsbutnotwithfibrosisintheclinicalcourseofproliferativediabeticretinopathy[J].CellCommunSignal,2013,7(1):1-9.

[13]NawrothP,BierhausA,MarreroM,etal.Antherosclerosisandrestenosis:istherearoleforRAGE[J].CurrDiabRep,2005,5(1):11-16.

[14]GaoX,ZhangH,SchmidtAM,etal.AGE/RAGEproducesendothelialdysfunctionincoronaryarteriolesintype2diabeticmice[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2008,295(2):H491-498.

[15]FengL,ZhuMM,ZhangMH,etal.ProtectionofglycyrrhizicacidagainstAGEs-inducedendothelialdysfunctionthroughinhibitingRAGE/NF-κBpathwayactivationinhumanumbilicalveinendothelialcells[J].Ethnopharmacol,2013,148(1):27-36.

RAGE/NF-κB signal pathway in mediating lysophosphatidylcholine-induced TGF-β1expression in human retinal endothelial cells*

YuRicheng,LuoJianhua△,FanYuanshuo,LiuBo

(DepartmentofEndocrinology,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou55000,China)

Objective To investigate the role of receptor for advanced glycation end products (RAGE)/NF-κB signaling pathway in mediating lysophosphatidylcholine (LPC)-induced TGF-β1expression in human retinal endothelial progenitor cells(HEPCs).Methods Human retinal endothelial cells (HERCs) were transfected with siRNA for RAGE siRNA or added NF-κB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) in the presence or absence of LPC,the expressions of TGF-β1and RAGE genes were analyzed by qPCR and Western blot.Results LPC could increase the expression of RAGE and TGF-β1gene in HERCs.The RAGE gene after silence could significantly decrease the expression of LPC-induced RAGE and TGF-β1.Adding NF-κB inhibitor PDTC significantly reduced LPC-induced RAGE and TGF-β1expression in HERCs.Conclusion RAGE/NF-κB signaling pathway plays an important role in mediating LPC induced TGF-β1gene expression in HERCs.

lysophosphatidylcholines;receptor for advanced glycation end products;human retinal endothelial cells;transforming growth factor beta1

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.008

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目[黔科合J字(2009)2]。 作者簡介：喻日成(1976-)，主治醫(yī)師，博士研究生，主要從事糖尿病慢性并發(fā)癥研究?！?/p>

，E-mail：luojianhua_gy@163.com。

R

A

1671-8348(2015)10-1319-03

2014-10-20

2014-12-20)