SPIO納米顆粒在肝癌磁共振早期診斷的基礎(chǔ)研究進(jìn)展

陳柱，肖恩華

中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院放射科，長沙410011

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是指肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，80%～90%為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)，本文中討論的肝癌即為肝細(xì)胞癌。肝癌是嚴(yán)重危害人們身體健康的主要的惡性腫瘤之一，具有病死率高以及預(yù)后差的特點，居世界癌癥死亡原因的第3位，僅次于肺癌和胃癌，每年約有60萬～70萬人死于肝癌，其中約一半發(fā)生在中國。在我國肝癌的病死率位居第2位，僅次于胃癌，并且大多數(shù)肝癌起病隱蔽，往往缺乏明顯特征性的癥狀或體征，患者就診時大多已屬中晚期或進(jìn)展期[1-2]。很大一部分患者發(fā)現(xiàn)肝癌后就已經(jīng)失去了最佳的治療時機，如果能夠及時發(fā)現(xiàn)肝癌，患者的治療效果將會得到大大改善，因此如何早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷肝癌非常重要，是肝癌診療領(lǐng)域中的重要課題之一。已有研究表明，磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)能夠準(zhǔn)確地對肝癌進(jìn)行顯示，能夠發(fā)現(xiàn)一些其他檢查手段例如CT不能發(fā)現(xiàn)的病變，但是對于發(fā)現(xiàn)比較小的病灶，特別是小于1 cm的肝癌和同時伴有肝硬化病人的肝癌尚有一定的困難[3-4]。近些年來，隨著分子影像學(xué)(molecular imaging)研究的不斷深入，為肝細(xì)胞癌的早期檢測和早期診斷提供了一種全新的思維方法[5]。以下從分子影像學(xué)的角度對超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO)納米顆粒在肝癌磁共振早期診斷方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 分子影像基本原理

分子影像學(xué)是一門新興的交叉科學(xué)，與傳統(tǒng)影像學(xué)的不同點在于其能夠?qū)⒎肿铀降母淖冊诨铙w狀態(tài)下顯示出來，從而定性及定量的對分子改變所導(dǎo)致的生物學(xué)行為通過影像的方法進(jìn)行分析，在組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞等不同層面對疾病進(jìn)行早期判斷[6]。磁共振成像及CT成像等廣泛使用的影像學(xué)診斷方法不能在形態(tài)學(xué)或組織學(xué)發(fā)生變化以前對疾病做出判斷，這些手段只能夠?qū)Ψ肿痈淖兯鶎?dǎo)致的最終的效應(yīng)進(jìn)行顯示。分子影像學(xué)與之不同，能夠在發(fā)生形態(tài)及解剖改變之前，對病變發(fā)生發(fā)展所產(chǎn)生的分子及細(xì)胞層面的改變進(jìn)行早期監(jiān)測，從而能夠在病變的早期做出及時的判斷，為疾病的診療提供有力的依據(jù)，極大地改變了以往的診療模式。

2 分子影像成像特征

分子影像的成像原理有3種，包括直接成像、間接成像、替代物成像。分子成像需要滿足以下幾點要求，一是需要有能夠高速及清晰成像的技術(shù)；二是需要有具備一定親和力和特異性的分子探針(molecular probe)；三是所選擇的分子探針有穿過生物屏障的能力，這就需要該探針具有良好的生物相容性，從而達(dá)到進(jìn)入靶細(xì)胞和靶器官的目的[7]。分子影像學(xué)與其他學(xué)科相比，有其自身的優(yōu)勢，一是能夠發(fā)現(xiàn)疾病早期的分子層面的變化以及病理改變，這是相對傳統(tǒng)檢測手段的一個巨大進(jìn)步；二是能夠在活體上對疾病分子病理水平的改變進(jìn)行監(jiān)測，并且早期連續(xù)地對基因治療和藥物治療的效果和機理進(jìn)行觀察；三是能夠?qū)?fù)雜生物學(xué)過程變成直觀的圖像，更好地反映分子水平的機制及特征；四是能夠在同一時間對多個分子事件進(jìn)行監(jiān)測。正是因為有了這些優(yōu)勢，在多種學(xué)科交叉的領(lǐng)域里，分子影像學(xué)已經(jīng)成為了研究熱點，其常用的成像技術(shù)主要有核醫(yī)學(xué)成像、磁共振成像、光學(xué)成像等。

探測設(shè)備及分子探針是促進(jìn)分子影像學(xué)提高的兩個主要方面，在探測設(shè)備方面，需要不斷提高技術(shù)，使成像的分辨率及敏感性得到提高，從而增加成像質(zhì)量；在分子探針方面，需要開發(fā)出靶向性好的特異性探針。優(yōu)質(zhì)的影像分子探針需要具備與靶結(jié)構(gòu)結(jié)合的特異性、一定的穿透性以及能產(chǎn)生良好的影像信號等特點[8-10]。納米顆粒需要具備以下幾個特點，才能夠有可能成為活體狀態(tài)下的分子成像探針，一是要有較大的表面積-容積比，顆粒較?。欢橇椒植挤秶?；三是可以將不同的物質(zhì)通過表面化學(xué)工程技術(shù)對其進(jìn)行表面修飾，從而增加其功能；四是能夠與較多的靶向配體結(jié)合，增加其與目標(biāo)器官或組織的親和性；五是具有較好的成像性質(zhì)；六是具有較低的生物毒性，以及能夠降解等。

3 SPIO的成像優(yōu)勢

臨床上常用的磁共振對比劑是釓劑，有一定的診斷價值，能夠增加病灶與正常組織之間的對比，反映病變的血供情況，從而提高診斷的準(zhǔn)確率[11]，但釓劑在體內(nèi)組織中呈非特異性分布，對早期腫瘤和較小的轉(zhuǎn)移瘤診斷的敏感性不高，對腫瘤組織和正常組織的分界往往不能準(zhǔn)確區(qū)分，并且有一定的腎毒性[12-13]。釓劑在腦、腎及血液系統(tǒng)的成像方面作用較明顯，在肝膽系統(tǒng)的成像效果欠佳，因此，要進(jìn)一步研究肝臟磁共振成像就需要進(jìn)一步研究肝臟特異性對比劑。目前有兩個主要研究方向，即網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)特異性對比劑以及肝細(xì)胞特異性對比劑[14]。

研究證明，氧化鐵對比劑能檢出微小病灶，提高惡性腫瘤的檢出率，對肝臟腫塊性病變的定性診斷有一定的幫助[15-16]。氧化鐵對比劑由氧化鐵晶體微粒包被而成，表面通常被覆多聚糖，使其在水的膠體溶液中具有穩(wěn)定性[17]，直徑從分布在十幾到幾千納米之間，顆粒的大小對顆粒的攝入機制和磁化特性有直接的影響，根據(jù)顆粒直徑可將其分為兩大類[18]：一類是超順磁性氧化鐵，另一類是超小型超順磁性氧化鐵(U1trasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)。超順磁性氧化鐵直徑為40納米到150納米之間[19]，主要被肝脾的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所攝入，在血漿的半衰期為8～10 min。超小型超順磁性氧化鐵顆粒直徑為20～40 nm[19]，分布在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和血池，在血漿的半衰期為200 min，其表面包有較厚的高分子物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠減弱超小型超順磁性氧化鐵與血漿蛋白和調(diào)理素的作用，影響超小型超順磁性氧化鐵被吞噬細(xì)胞攝入，由于腫瘤轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)內(nèi)大部分為腫瘤細(xì)胞，對超小型超順磁性氧化鐵的吞噬減少，而正常淋巴結(jié)內(nèi)與超小型超順磁性氧化鐵的親和性不改變，超小型超順磁性氧化鐵被正常淋巴結(jié)所攝取，這種情況下，正常淋巴結(jié)與腫瘤轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)之間的磁共振信號差別就可以顯現(xiàn)出來，能夠作為監(jiān)測癌癥患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個手段，達(dá)到提高診療效果的目的[20-21]。

超順磁性氧化鐵具備良好的磁性、化學(xué)穩(wěn)定性、表面活性及生物相容性，且制備簡單，在材料、醫(yī)藥、生物技術(shù)以及催化領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景。應(yīng)用最多的是Advance Magnetic公司生產(chǎn)的 AMI-25(Ferumoxides,商品名Feridex,菲立磁)，F(xiàn)eridex的平均直徑為80 nm，其氧化鐵晶體核心的直徑為20 nm，作為在醫(yī)療市場使用的超順磁氧化鐵納米粒制劑，菲立磁是第一個通過美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的，并且是首個進(jìn)入臨床試驗超順磁氧化鐵納米粒制劑。它以鐵氧化物為核心(粒徑為20 nm)，其表面被葡聚糖-T10包裹，包被粒子流體粒徑為120～180 nm之間，弛豫率R1=10.l/(mM·s)，R2=120/(mmol·s)，在血液中的半衰期約為8 min，靜脈注射30 min后基本被人體肝脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，所攝取的80%以上被肝臟的肝竇壁上的枯否細(xì)胞吞噬，分布在脾臟的占6%～10%，靜脈注射2 h后，肝臟SPIO的含量達(dá)到最高值，約為總量的89%[22]。在人體內(nèi)可降解，在肝臟內(nèi)的半衰期約為3～4d，給藥后轉(zhuǎn)移性腫瘤不攝取超順磁氧化鐵納米顆粒，磁共振信號未見顯著改變，與之相對的是，正常肝組織能夠攝取超順磁氧化鐵，因此其磁共振信號降低，在腫瘤與正常肝組織之間形成信號差別，對較小的腫瘤有一定的診斷價值[23-24]。

4 SPIO納米顆粒的特征

超順磁氧化鐵納米顆粒具有以下特征：(1)有較窄的粒徑分布范圍，較小的粒徑，較大的相對表面積。(2)可被多種物質(zhì)修飾顆粒表面，例如對比劑、靶向配體、核酸等，使其具有多功能性。(3)一個納米顆?？山Y(jié)合多個靶向配體，增加其與目標(biāo)受體之間的親和力。(4)具有較低的毒性，具有生物可降解性。這些特征使得納米顆粒具備作為活體分子成像探針的能力。

SPIO是磁共振陰性對比劑，包被葡聚糖右旋糖酐或其他物質(zhì)的Fe3O4顆粒是其有效成分,具有網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)靶向性分布的特點，能夠被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識別并且被吞噬細(xì)胞當(dāng)作異物攝取。由于超順磁氧化鐵的這種特殊結(jié)構(gòu)，在較弱的磁場可顯示較強的磁性，當(dāng)外加磁場消除后其磁性也很快消失，即所謂的超順磁性。相對于傳統(tǒng)的磁共振對比劑釓劑，SPIO具有很多優(yōu)點，例如生物相容性較好，毒性較低，磁場敏感性較強，可以使質(zhì)子弛豫率增強，使橫向弛豫(T2)時間縮短[25]，從而使病變與周圍組織的對比度增大，使圖像的分辨率提高。肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中含有Kupffer細(xì)胞，Kupffer細(xì)胞可以攝取超順磁氧化鐵，使正常肝組織的磁共振信號降低，由于Kupffer細(xì)胞在肝臟大部分惡性腫瘤中非常少或者缺乏，所以肝臟惡性腫瘤的磁共振信號無明顯變化，這種情況下病變與正常肝組織的T2序列磁共振信號差別加大,產(chǎn)生磁共振負(fù)性強化。

5 SPIO磁共振成像的優(yōu)化

Weissleder等[26]首先成功制備出標(biāo)記阿拉伯半乳糖衣和去唾液酸胎蛋白的超順磁氧化鐵及超微型超順磁氧化鐵顆粒，使SPIO靶向聚集到肝組織的能力得到提高。張曉東等[5]制備半乳糖基白蛋白-SPIO，發(fā)現(xiàn)其主要作用于肝實質(zhì)細(xì)胞，肝臟負(fù)性強化效應(yīng)較好，有助于發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)的小腫瘤。焦志云等[27]制備殼聚糖-g-聚丙烯酸(CS-g-PAA)修飾的SPIO，并用1.5 T磁共振儀對其穩(wěn)定性進(jìn)行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)磁共振信號在濃度低于20 mg/l時改變明顯，T2*WI為最敏感的磁共振檢測序列。Simon等[28]通過對細(xì)胞內(nèi)外SPIO的弛豫率測定發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外游離的SPIO的T1和T2弛豫率明顯高于細(xì)胞內(nèi)，說明SPIO在細(xì)胞內(nèi)外對MRI信號的影響是不同的。

Sun C等[29]以Fe3O4納米顆粒(NPs)為核心，在外包裹聚乙烯乙二醇(poly-ethylene glycol,PEG)及氯離子通道蝎毒素(Chlorotoxin,CTX)，首次開發(fā)出了CTX-超順磁納米探針，研究顯示該納米顆?？膳c膠質(zhì)瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，在磁共振顯像中可以作為磁共振對比劑，可以提高腫瘤和正常腦組織之間的分辨性能，且沒有急性的毒副作用。Veiseh O 等[30]2005年開發(fā)出一種多功能的納米顆粒探針(NP-PEG-CTX-Cy5.5)，該微粒將Fe3O4納米顆粒的表面覆以共價結(jié)合的PEG，然后將熒光分子Cy5.5與CTX分別共價結(jié)合在此顆粒上。該探針可以標(biāo)記膠質(zhì)瘤細(xì)胞，可以同時被MRI以及熒光顯微鏡檢測。Veiseh M 等[31]將CTX與Cy5.5結(jié)合，產(chǎn)生復(fù)合物CTX-Cy5.5，通過小鼠膠質(zhì)瘤模型尾靜脈注入0.1 ml 20 μmol/L的CTX-Cy5.5，連續(xù)用小動物體內(nèi)成像系統(tǒng)(Xenogen IVIS-100 system)觀察14 d，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞種植部位的信號持續(xù)明顯高于正常組織。2010年8月，該團隊研制出一個納米基因載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)有聚胺基葡糖共聚體(a copolymer of chitosan)、GFP(green fluorescent protein)熒光染料、PEG、聚乙烯亞胺聚合體(PEI)以及CTX，采用共焦熒光顯微鏡以及Xenogen IVIS熒光成像對GFP的基因表達(dá)進(jìn)行分析，采用組織病理學(xué)方法及磁共振對聚集在腫瘤部位的納米粒子進(jìn)行檢測，CTX雖然對聚集在腫瘤部位的納米粒子無明顯影響，卻可以對攝取的癌細(xì)胞產(chǎn)生高基因表達(dá)，這種納米載體在提高基因治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤和其他致命的癌癥方面是有潛力的[32]。2010年11月，Veriseh等[33]研究發(fā)現(xiàn)核糖核酸干擾(RNAi)治療癌癥是一種有潛力的方法，通過與該納米探針結(jié)合，能有效地傳遞短干擾RNA(siRNA)，從而提高了治療腫瘤的特異性。Veiseh O等[34]2009年合成了CTX修飾的SPIO-NPs納米粒子，CTX對以下兩種物質(zhì)有親和性，即氯離子通道的脂類復(fù)合物以及MMP-2，因此這種經(jīng)過CTX修飾的納米顆?？梢詫?xì)胞的攝取起到積極作用。

6 SPIO與肝癌靶向性的建立

在慢性肝炎和肝硬變的肝組織內(nèi)，MMP-2的表達(dá)較弱[35]，而在肝癌中MMP-2有較高的表達(dá)，并且腫瘤的侵襲性、分化程度、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)趨勢能夠影響此種表達(dá)[36-37]。洪堅善等[38]發(fā)現(xiàn)MMP-2在肝癌中的表達(dá)比正常組織和癌旁組織都高,并且與兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而MMP-2在正常組織和癌旁組織中表達(dá)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，此外癌組織中MMP-2的表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)時間呈負(fù)相關(guān)，與肝外轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與病理學(xué)分級呈正相關(guān)。Cui J等[39]發(fā)現(xiàn)MMP-2與肝細(xì)胞癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)有密切關(guān)系。白旭明等[40]研究顯示兔肝VX2移植瘤MMP-2表達(dá)與人肝細(xì)胞癌相似。因此，MMP-2有成為肝癌靶點的潛質(zhì)。

CTX是一種從以色列金蝎的毒液中提取、包含36個氨基酸(其中包含1個酪氨酸殘基、8個半胱氨酸殘基)和4個雙硫鍵的多肽，分子重量為3950Da，其中酪氨酸殘基可以進(jìn)行放射性碘標(biāo)記[41]。氯離子通道蝎毒素可選擇性和特異性與MMP-2結(jié)合[42]，而MMP-2在肝癌中高表達(dá)，故氯離子通道蝎毒素就可以通過MMP-2與肝癌建立起靶向聯(lián)系。

PEG[43-44]是一種常用的表面修飾材料，具有很好的親水性，同時沒有免疫原性，PEG便宜易得，呈中性，無明顯毒性，有良好的生物相容性，溶于水和多種有機溶劑，能夠通過端基反應(yīng)性以嵌段或接枝的方法連接到納米顆粒上，使其具有親水性，增強其穩(wěn)定性，延長在血液內(nèi)的循環(huán)時間，減少納米顆粒被巨噬細(xì)胞的吞噬。因此，通過PEG的表面修飾作用，可以使SPIO與CTX和MMP-2相結(jié)合，從而建立SPIO與肝癌之間的靶向性。

7 展望

以上研究說明，經(jīng)過CTX修飾的SPIO納米顆粒能夠通過MMP-2與肝癌建立靶向聯(lián)系，據(jù)此可設(shè)計出與肝癌靶向結(jié)合的超順磁納米顆粒，作為肝癌的磁共振特異性對比劑，實現(xiàn)SPIO分子探針應(yīng)用到肝癌早期磁共振診斷的目的。這種研究已經(jīng)引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注，但尚無深入的研究成果，需要更多的學(xué)者更加深入的研究。

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