鹽酸法舒地爾對(duì)慢性腦低灌注損傷大鼠海馬細(xì)胞的保護(hù)作用

孫　莉　梅　瑰　郭蓮軍　陳玉華

430010　武漢，長江航運(yùn)總醫(yī)院 武漢腦科醫(yī)院[孫　莉　梅　瑰　陳玉華(通信作者)]；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理系(郭蓮軍)

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鹽酸法舒地爾對(duì)慢性腦低灌注損傷大鼠海馬細(xì)胞的保護(hù)作用

孫莉梅瑰郭蓮軍陳玉華

430010武漢，長江航運(yùn)總醫(yī)院 武漢腦科醫(yī)院[孫莉梅瑰陳玉華(通信作者)]；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理系(郭蓮軍)

鹽酸法舒地爾(hydroxy fasudil, HF)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為6(H)-1-(5-磺?；愢?-1(H)-1，4-二氮雜卓鹽酸鹽[1]，作為一種擴(kuò)血管藥物首次在日本上市，主要應(yīng)用于改善及預(yù)防蛛網(wǎng)膜下腔出血術(shù)后的腦血管痙攣及隨之引起的腦缺血癥狀，一種Rho激酶特異性抑制劑，通過抑制Rho激酶舒張血管增加腦供血并抑制炎癥反應(yīng)[2]，上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)[3]改善血管內(nèi)皮功能，稀釋血液降低血液粘滯度[4]，并抑制中性粒細(xì)胞的遷移[5]。慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙是臨床上常見的腦損傷之一，已成為研究的熱點(diǎn)，其損傷機(jī)制尚未闡明。鹽酸法舒地爾不僅可以通過抑制Rho激酶來緩解腦缺血癥狀，還可以通過直接作用于受損神經(jīng)元而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[6-7]。海馬是參與學(xué)習(xí)與記憶功能的重要腦區(qū)，本研究應(yīng)用水迷宮實(shí)驗(yàn)及HE染色觀察慢性腦缺血后及經(jīng)鹽酸法舒地爾治療30 d后對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響及海馬細(xì)胞形態(tài)的變化，從而探討鹽酸法舒地爾改善慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙的機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，清潔級(jí)，體重180～220 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物證號(hào)：No19-050)。大鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，維持室溫20～22 ℃，自由攝食與飲水，自然光照節(jié)律，每天提供足量的食物和水。

1.2主要藥品和試劑

鹽酸法舒地爾(hydroxy fasudil，HF)，白色粉劑，純度>98%，Tocris Cookson Ltd. (Britol, UK)公司生產(chǎn)，批號(hào)040311，臨用前用生理鹽水溶解并稀釋至所需濃度，注意避光。其余藥品和試劑均為市售分析純。

1.3動(dòng)物模型制備

大鼠慢性不完全性全腦缺血模型采用大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎(permanent occlusion of the bilateral CCA, 2VO)制備。大鼠用10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥位固定，頸部去毛，強(qiáng)力碘消毒，頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并套以“0”號(hào)線，分別結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈的近心端和遠(yuǎn)心端，并從中間剪斷，以確保阻斷頸總動(dòng)脈血流；縫合后腹腔注射生理鹽水4～5 mL，放回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不結(jié)扎、不剪斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其余過程與模型組相同。術(shù)中保持大鼠肛溫36.5～37.5 ℃。各組大鼠同條件飼養(yǎng)，在相同時(shí)間點(diǎn)作各種檢測(cè)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組與給藥

將Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為3組，即(1)假手術(shù)組；(2)腦缺血模型組：永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈(permanent occlusion of the bilateral CCA, 2VO)；(3)HF治療組：2VO + HF 10 mg/kg。2VO術(shù)后第1 d開始腹腔注射給藥，假手術(shù)組和腦缺血模型組分別給予等體積的生理鹽水；HF治療組給予鹽酸法舒地爾10 mg/kg，1次/d，持續(xù)30 d。

1.5大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力檢測(cè)

大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎30 d后用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力；實(shí)驗(yàn)裝置為一直徑為200 cm，高50 cm的不銹鋼的圓柱形水池，等分為4個(gè)象限；將一直徑約為10 cm的平臺(tái)固定于其中某一象限正中心的位置；水深約為30 cm，平臺(tái)隱沒在水平面下1.5 cm，水中加入奶粉，使水成為不透明的乳白色，以致看不見平臺(tái)位置。測(cè)試程序包括(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：大鼠連續(xù)訓(xùn)練5 d，每天分上、下午兩個(gè)時(shí)段，每個(gè)時(shí)段訓(xùn)練4次。每次實(shí)驗(yàn)大鼠在4個(gè)不同象限中點(diǎn)頭朝池壁放入水池，次序每天不同，任其游泳，直至找到平臺(tái)；大鼠找到平臺(tái)時(shí)間和軌跡由水池上方的攝像機(jī)記錄；180 s內(nèi)到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期，4個(gè)象限記錄的時(shí)間的平均值作為當(dāng)天大鼠的逃逸潛伏期；(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第6 d，撤除平臺(tái)，記錄大鼠在180 s內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間；采用MT-200水迷宮圖像追蹤系統(tǒng)監(jiān)測(cè)大鼠游泳軌跡；水迷宮實(shí)驗(yàn)在每天早上10:30～12:00進(jìn)行。

1.6組織學(xué)觀察

大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹腔注射20%烏拉坦0.6 mL/100 g麻醉，于30～40 min內(nèi)從左心室快速灌注生理鹽水100～150 mL，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛500 mL；大鼠靜置于4 ℃冰箱，3 h后取出大腦，置4 ℃的同樣的固定液中過夜，經(jīng)梯度酒精(濃度依次為80%、95%、100%)上行脫水、二甲苯透明后石蠟包埋；自前囟后2.0 cm處以5 um的厚度行連續(xù)冠狀位切片；石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟透明、梯度酒精(濃度依次為100%，95%)下行至水后PBS漂洗2次，每次5 min；加入蘇木素染色5 min后自來水沖洗10 min，1%鹽酸水溶液分色，自來水沖洗10 min，伊紅染色5 min；切片經(jīng)酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片；普通光學(xué)顯微鏡下觀察皮層、海馬細(xì)胞形態(tài)變化。

1.7在體電生理記錄

各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后烏拉坦(1.5 g/kg, ip)麻醉，用恒溫水循環(huán)系統(tǒng)維持大鼠體溫至37 ℃；頭部固定于腦立體定位儀(SN-3, 5 Narishige, Japan)，在無菌條件下剪開皮膚和筋膜暴露頭骨，刺激電極插入海馬Schaffer 側(cè)枝(前囟后3.5～4.0 mm；中縫旁3.1～3.5 mm；硬膜下2.2～2.5 mm)；記錄電極分別定位于同側(cè)海馬CA1(前囟后3.2～3.6 mm；中縫旁2.2～2.5 mm；硬膜下1.8～2.2 mm)，電極定位完畢后休息30 min；開始實(shí)驗(yàn)，刺激持續(xù)時(shí)間0.15 ms，刺激頻率30 Hz，刺激強(qiáng)度為5～30 V；測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的群峰電位(population spike, PS)幅度，以刺激前基線記錄的PS平均幅度為100%進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；用RM6240BD 生物信號(hào)記錄系統(tǒng)記錄、放大、監(jiān)測(cè)和分析生物信號(hào)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，運(yùn)用one/two-way ANOVA分析組間差異，P<0.05表示顯著性差異。

2結(jié)果

2.1鹽酸法舒地爾對(duì)大鼠慢性腦缺血所致空間學(xué)習(xí)記憶能力減退的影響

水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠尋找平臺(tái)時(shí)間即逃避潛伏期與假手術(shù)組比較，明顯延長，腦缺血模型組與假手術(shù)組比較逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)；鹽酸法舒地爾治療組大鼠逃避潛伏期與腦缺血模型組比較有顯著縮短(P<0.05)(圖1)。

空間探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦缺血模型組大鼠在原來平臺(tái)所在象限停留時(shí)間與假手術(shù)組比較明顯縮短(P<0.05)，腦缺血鹽酸法舒地爾治療組顯著延長大鼠在靶象限中的停留時(shí)間(P<0.05)(圖2)。

圖1 各組大鼠逃避潛伏期隨時(shí)間變化 與假手術(shù)組比較,#P<0.05;與腦缺血模型組比較,*P<0.05

圖2 各組大鼠在原平臺(tái)所在象限探索時(shí)間 與假手術(shù)組比較,*P<0.05,與腦缺血模型組比較,#P<0.05

2.2鹽酸法舒地爾對(duì)2VO大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞丟失的影響

組織學(xué)觀察顯示，光鏡下假手術(shù)組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整，無異常改變；慢性腦缺血30 d后可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)較紊亂，神經(jīng)元丟失；經(jīng)鹽酸法舒地爾治療30 d后神經(jīng)元丟失現(xiàn)象減少，明顯優(yōu)于模型組(圖3～4)。

圖3 各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色×200倍) A為假手術(shù)組;B為腦缺血模型組;C為HF治療組

圖4 各組大鼠海馬CAI區(qū)存活細(xì)胞百分率 與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與腦缺血模型組比較,#P<0.05

2.3鹽酸法舒地爾對(duì)慢性腦低灌大鼠海馬突觸傳遞功能的影響

在體電生理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組、腦缺血模型組、HF治療組大鼠強(qiáng)直刺激海馬CA1區(qū)PS幅值變化百分率，模型組大鼠PS幅值明顯被抑制，其PS相對(duì)幅值均顯著低于假手術(shù)組組(P<0.05)，HF治療組大鼠PS幅值明顯改善，顯著高于模型組(P<0.05)(圖5)。

圖5 鹽酸法舒地爾對(duì)慢性腦低灌大鼠海馬CA1群峰電位幅度的影響 模型組與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與腦缺血模型組比較,#P<0.05

3討論

腦組織缺血后神經(jīng)細(xì)胞的損傷有許多病理生理過程參與，目前認(rèn)為興奮性氨基酸釋放、神經(jīng)細(xì)胞鈣離子超載、氧自由基產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等因素均參與了腦缺血所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷的發(fā)生與發(fā)展[8-9]。腦缺血時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載可以引起Rho激酶的活化，與腦血管痙攣有密切關(guān)系。隨著國際上實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)展，越來越多的研究證實(shí)Rho激酶不僅與血管痙攣有關(guān)，與腦缺血后神經(jīng)元細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷亦密切相關(guān)[10]。Rho激酶在腦缺血神經(jīng)元損傷的病理生理過程中占有重要地位,可以改變蛋白的磷酸化過程并影響基因組表達(dá)和蛋白合成，從而參與谷氨酸的神經(jīng)毒性作用以及促進(jìn)炎癥/氧化應(yīng)激，進(jìn)一步引起神經(jīng)元的磷脂膜、細(xì)胞骨架蛋白、核酸等重要結(jié)構(gòu)的解體，導(dǎo)致腦神經(jīng)信息發(fā)生紊亂，能量代謝功能障礙，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)元缺血性變性、凋亡和壞死，這是血管性認(rèn)知障礙及癡呆發(fā)生機(jī)制之一[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制Rho激酶對(duì)于海馬的缺血性損傷有重要治療意義[13]。

本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈方法制作慢性低灌性大腦缺血模型，觀察Rho激酶特異性抑制劑法舒地爾對(duì)大鼠腦缺血后海馬細(xì)胞的保護(hù)作用。大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎致慢性大腦缺血30 d后，水迷宮行為學(xué)檢測(cè)顯示，模型組大鼠逃離潛伏期延長、在目標(biāo)象限中游泳時(shí)間縮短，提示其學(xué)習(xí)記憶功能明顯受損；海馬組織病理切片可見慢性腦低灌注缺血可導(dǎo)致CA1神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)核深染,細(xì)胞丟失，這與相關(guān)研究報(bào)道一致[10]。給予Rho激酶特異性抑制劑法舒地爾腹腔注射30 d后腦缺血的SD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力均有明顯改善，并能明顯減輕海馬神經(jīng)細(xì)胞的丟失。提示鹽酸法舒地爾改善大鼠慢性低灌所引起的認(rèn)知功能障礙與對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用有關(guān)。在體電生理實(shí)驗(yàn)顯示，鹽酸法舒地爾可明顯逆轉(zhuǎn)慢性腦低灌注缺血大鼠CA1群峰電位幅度的降低，表明對(duì)海馬突觸傳遞功能損傷有改善作用。

缺血性腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，許多病理生理過程都參與了缺血性腦血管疾病中神經(jīng)元損傷的發(fā)生與損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)展，鹽酸法舒地爾亦有可能通過其它的途徑改善慢性腦缺血所致的認(rèn)知功能障礙。詳細(xì)作用機(jī)制有待深入研究。

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(2015-04-28收稿)

【摘要】目的觀察Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾(hydroxy fasudil, HF)對(duì)慢性低灌注腦缺血所致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法采用永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈(permanent occlusion of the bilateral CCA, 2VO)制備大鼠慢性不完全性全腦缺血模型，將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血模型組和HF治療組，運(yùn)用Morris 水迷宮行為學(xué)方法檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力；用HE染色觀察海馬組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果Morris 水迷宮檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損，與假手術(shù)組比較逃避潛伏期延長、空間辨別能力下降；組織學(xué)觀察模型組大鼠海馬CA1細(xì)胞發(fā)生丟失，組織結(jié)構(gòu)異常。連續(xù)給予鹽酸法舒地爾30 d能改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，減少腦缺血所致的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞丟失。結(jié)論鹽酸法舒地爾可減少慢性腦缺血所致的大鼠海馬神經(jīng)元的丟失，改善學(xué)習(xí)記憶功能。

【關(guān)鍵詞】鹽酸法舒地爾Rho激酶腦缺血海馬神經(jīng)細(xì)胞HE染色

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2015.04.006

Neuroprotective effects of hydroxy fasudil on brain hippocampal neurons damage of chronic cerebral hypoperfusion rat modelSunLi,MeiGui,GuoLianjun,etal.DepartmentofNeurology,GeneralHospitaloftheYangtzeRiver(WuhanBrainHospital),Wuhan430010

【Abstract】ObjectiveTo observe the neuroprotective effects of hydroxy fasudil (HF), a Rho-kinase inhibitor, on hippocampal neurons damage after chronic cerebral hypoperfusion in a rat model.MethodsChronic cerebral hypoperfusion in rats was performed by permanent occlusion of the bilateral common carotid artery (2VO). SD rats were divided into three groups: sham-operated group, ischemic group and HF treated group (10 mg/kg). Morris water maze was used to measure spatial learning and memory performance. HE stain was used to observe morphology change.ResultsCompare with sham-operation group, 2V0 rats resulted in spatial learning and memory impairments shown by longer escape latency and shorter time spent in the target quadrant. Morphological observe of 2V0 rats hippocampal show CA1 neurons lost. Administration of hydroxy fasudil (10 mg/kg, once per day for 30days) can improve 2V0 rats learning and reduce the neuron lost.ConclusionsLong-term administration of hydroxy fasudil markedly attenuated chronic cerebral hypoperfusion induced neuronal damage.

【Key words】Hydroxy fasudilRho kinaseCerebral ischemiaHippocampal neuronsHE stain

【中圖分類號(hào)】R743

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1007-0478(2015)04-0215-04

基金項(xiàng)目：交通運(yùn)輸部長江航務(wù)管理局課題(201210011)；武漢市衛(wèi)計(jì)委臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(WX14D12)