α7nAChR 基因敲除小鼠的飼養(yǎng)繁育及基因型鑒定*

*基金項目：國家自然科學(xué)基金項目 (81100279)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃項目(2014R410058)。

α7nAChR 基因敲除小鼠的飼養(yǎng)繁育及基因型鑒定*

*基金項目：國家自然科學(xué)基金項目 (81100279)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃項目(2014R410058)。

★李富強1吳小翠1陳小梅1唐翠蘭2**(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院杭州 310053；2.浙江省新華醫(yī)院感染科杭州 310006)

摘要：目的：繁殖和鑒定煙堿型乙酰膽堿受體α7基因敲除小鼠。方法：將引進的α7nAChR基因敲除雜合子小鼠進行飼養(yǎng)并繁殖，提取子代小鼠尾部 DNA，用 PCR 方法檢測子代小鼠基因型；采用 Western blot 檢測α7nAChR 蛋白質(zhì)的表達(dá)，進一步證實 PCR 鑒定方法的可靠性。結(jié)果：獲得子代 (α7nAChR+ / +) ，子代小鼠純合率為 30%。結(jié)論：α7nAChR基因敲除小鼠的繁育和鑒定均獲得成功，為進一步研究α7nAChR 缺失對非酒精性脂肪性肝炎的影響提供了理想的動物模型。

關(guān)鍵詞：煙堿型乙酰膽堿受體α7; 基因敲除小鼠; 非酒精性脂肪性肝炎

煙堿型乙酰膽堿受體α7(α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR)是配體門控離子通道蛋白超家族的典型代表，煙堿型乙酰膽堿受體的一個重要亞型，是復(fù)雜的五聚體跨膜蛋白[1]。α7nAChR分布廣泛且功能多樣，不僅分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在外周神經(jīng)系統(tǒng)也有廣泛表達(dá)，介導(dǎo)著神經(jīng)元的快速突觸傳遞[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，α7nAChR在身體多個部位的非神經(jīng)元細(xì)胞和組織中亦有表達(dá)，通過活化膽堿能抗炎通路參與多種炎癥反應(yīng)的調(diào)控。它的激活可以有效減少多種促炎因子的釋放，對局部和全身炎癥具有明顯的抑制作用[4]。巨噬細(xì)胞是參與膽堿能抗炎通路的主要靶細(xì)胞[5]。膽堿能抗炎通路主要通過活化巨噬細(xì)胞表面的α7nAChR發(fā)揮抗炎作用[6]。在前期實驗中，我們給予NASH小鼠體外腹腔注射煙堿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以減輕NASH的炎癥反應(yīng)，其作用機制主要是活化α7nAChR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路，通過調(diào)控NF-κB和MAPK信號通路，減輕NASH的炎癥反應(yīng)。為了進一步明確α7nAChR在NASH小鼠中的作用機制以及該基因的缺失會對小鼠NASH炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的影響，我們從美國杰克遜實驗室(Jackson Laboratory)成功引入了α7nAChR基因敲除雜合子小鼠，在 SPF級動物房中飼養(yǎng)、繁殖，基因鑒定出一批子代純合子基因敲除小鼠。

1材料與方法

1.1實驗動物α7nAChR基因敲除小鼠由美國 Jackson 實驗室引進( Stock Number: 003232, Strain Name:B6.129S7-Chrna7tm1Bay/J) ，品系背景為 C57BL/6J，雌雄各 3 只，基因型為雜合子(α7nAChR + /-) 。

1.2主要試劑及儀器小鼠組織DNA提取、PCR反應(yīng)(美國KAPA Mouse Genotyping Kit)，DNA Marker(上海江萊生物科技有限公司)，5×TBE、溴化乙啶溶液(北京索萊寶科技有限公司)，瓊脂糖(BIOWEST)，6×Loading buffer(寶生物工程(大連)有限公司) ；DK-8D 型三孔電熱恒溫水槽( 上海恒科技有限公司)，UNO-Ⅱ型 PCR 儀(美國 Biometra 公司)，Eppendorf 5804R 低溫離心機 ( 德國Eppendorf AG)， FR-250 電泳儀，F(xiàn)R-980A 生物電泳圖像分析系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)；Anti-α7nAChR抗體(美國Proentech公司)，Anti-GAPDH抗體(Cell Signal公司)，Goat anti-rabbit IgG-HRP(上海博谷生物科技有限公司)；蛋白裂解液 RIPA、BCA 蛋白濃度測定試劑盒( 上海碧云天生物技術(shù)有限公司) ，蛋白酶抑制劑 PMSF(Sigma公司)。

1.3基因敲除小鼠的飼養(yǎng)和繁殖小鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心SPF 環(huán)境中，室內(nèi)溫度控制在 22℃～26℃ ，濕度50% ～ 60% ，明暗循環(huán) 12 h / d，自由飲食和飲水，小鼠籠盒、墊料、飲用水均經(jīng)高溫高壓滅菌處理。飼料購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。飼養(yǎng)過程中，每天進入動物房1 次，觀察小鼠生長情況，墊料每周更換3次，每天補充飼料和飲用水。小鼠2個月后性能力發(fā)育成熟，將其雌雄等比例同籠合養(yǎng)。雌性小鼠的妊娠期和哺乳期為3周左右，過哺乳期后把小鼠與母鼠分開，雌雄分開飼養(yǎng)，以免影響實驗數(shù)據(jù)的精確性。用于繁殖的小鼠要定期給予滅菌葵花籽和蛋黃以補充營養(yǎng)以增強其繁殖能力。

1.4小鼠的基因型鑒定國外購買的α7nAChR敲除小鼠是雜合子小鼠，根據(jù)孟德爾定律，其子代可能基因型為雜合子(α7nAChR+/-) 、純合子(α7nAChR-/-) 及野生型(α7nAChR+/+) ，所以必須對它們進行基因型鑒定。

1.4.1小鼠組織 DNA 的提取剪取小鼠尾巴約1～3mm，放入1.5 mL 離心管中，然后分別加入以下反應(yīng)物：10× KAPA Express Extract Buffer10μL、1U/μL KAPA Express Extract Enzyme 2μL，輕輕混勻,75℃水浴10min，95℃水浴5min，渦旋震蕩3s，12000g離心1min，轉(zhuǎn)移上清至新的1.5mLEP管中。

1.4.2PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)引物由生工生物工程(上海)公司合成。引物1:CCC TTT ATA GAT TCG CCC TTG 用于檢測突變型; 引物 2: ATC AGA TGT TGC TGG CAT GA用于檢測野生型; 引物 3: TTC CTG GTC CTG CTG TGT TA 作為通用引物。PCR擴增:根據(jù)KAPA Mouse Genotyping Kit 使用說明，按25μL反應(yīng)體系進行擴增。分別加入如下反應(yīng)物:DNA模板1μL、突變引物(0.5μmol.L-1)1.25μL、野生型引物(0.5μmol.L-1)1.25μL、通用引物(0.5μmoL/L)1.25μL、2×KAPA 2G Fast Genotyping Mix(1×)12.5μL、1.5mM氯化鎂0.5μL，加ddH2O補足至25μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s/kb，循環(huán)35次，72℃最后延伸5min終止反應(yīng)，4℃保存。

1.4.3瓊脂糖電泳及基因型鑒定瓊脂糖1.5g，0.5×TBE100mL，溴化乙啶(EB)5μL，PCR產(chǎn)物10μL，上樣緩沖液1μL，DNA Marker 4μL，電泳電壓100V，時間為60min。

引物1擴增產(chǎn)物大小為187bp，為純合子小鼠;引物2擴增產(chǎn)物大小為390bp，為野生型小鼠;187bp、390bp這2條電泳條帶均存在的為雜合子小鼠。

1.5Western blot分析α7nAChR蛋白質(zhì)的表達(dá)

1.5.1組織蛋白提取將小鼠肝臟組織用PBS洗凈，置于離心管中，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，每100mg肝組織加入500μL含PMSF的RIPA蛋白裂解液，于手動勻漿器上進行勻漿1min后置于冰上，幾分鐘后再行勻漿，再置于冰上，如此重復(fù)，裂解30min后，在4℃下12000g離心15min，取得上清即為蛋白。將組織中提取的蛋白用BCA法測定細(xì)胞蛋白濃度后，加上樣緩沖液后沸水煮10min后迅速水浴冷卻。

1.5.2蛋白電泳和Western blot 檢測采用10﹪SDS-PAGE膠，120V電泳1.5h將蛋白質(zhì)分離；300mA，4℃轉(zhuǎn)膜2h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜。用含5%脫脂牛奶的TBST在室溫下封閉2小時后，分別加入Anti-α7nAChR抗體(1∶500)和Anti-GAPDH抗體(1∶1000)4℃孵育過夜，TBST洗滌3次。分別加入Goat anti-rabbit IgG-HRP(1∶5000)，室溫孵育1小時，TBST洗滌3次后，加化學(xué)發(fā)光底物作用3分鐘，暗室曝光，顯影，定影。

2結(jié)果

2.1部分小鼠基因型鑒定結(jié)果親代α7nAChR基因敲除小鼠均為雜合子配種，子代小鼠有雜合、純合和野生型3種基因型。如圖1所示，3、4、6號小鼠電泳條帶位于390bp和187bp處為雜合子;2、5號小鼠電泳條帶位于187bp處為純合子;1號小鼠電泳條帶位于390bp處為野生型。

圖1　子代小鼠α7nAChR基因鑒定結(jié)果

2.2α7nAChR基因敲除小鼠繁育生長情況6個月共繁育小鼠3代/次，得到子代小鼠30只，其中雄性21只，雌性9只；經(jīng)基因型鑒定，獲得α7nAChR+/+小鼠5只，α7nAChR+/-小鼠16只，α7nAChR-/-小鼠9只，純合小鼠比例為30%；新生小鼠呈肉色，還沒長出毛，眼睛閉著，尾短，四肢柔弱，平時躺著不動，平均斷乳期為21d；成年小鼠體重相對C57BL/6J沒有較大差別，但是繁殖能力相對弱，會出現(xiàn)食仔、脫毛等現(xiàn)象，見圖2。

圖2　α7nAChR基因敲除小鼠新生2日齡及30日齡幼鼠

2.3基因敲除小鼠α7nAChR蛋白質(zhì)表達(dá)為了進一步驗證PCR結(jié)果的可靠性，我們選取經(jīng)PCR鑒定獲得的純合子和野生型小鼠，應(yīng)用Western Blot的方法檢測α7nAChR蛋白在肝臟組織中的表達(dá)。結(jié)果如圖3所示，純合子小鼠肝臟組織未檢測到α7nAChR蛋白質(zhì)的表達(dá)，而野生型小鼠肝臟可見α7nAChR蛋白的表達(dá)，PCR方法鑒定所得的結(jié)果一致。

3討論

慢性炎癥反應(yīng)在NASH的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[7]。來源于肝臟巨噬細(xì)胞的炎癥因子對NASH的發(fā)生發(fā)展起重要作用[8]，巨噬細(xì)胞失活后可以阻斷NASH大鼠肝脂肪變性和炎癥的發(fā)展[9]。α7nAChR與TLR-4在巨噬細(xì)胞表面均有表達(dá)，α7nAChR介導(dǎo)的抗炎信號傳導(dǎo)通路與TLR-4介導(dǎo)的致炎信號傳導(dǎo)通路均通過NF-κB和MAPK信號通路來發(fā)揮作用。巨噬細(xì)胞的活化主要由腸道來源的內(nèi)毒素脂多糖(1ipopoLysaccharides，LPS)啟動[10]，LPS通過與巨噬細(xì)胞TLR-4結(jié)合，活化MAPK和NF-κB信號通路[11]，導(dǎo)致細(xì)胞因子IL-6、TNF-α產(chǎn)生[12]。另外，活化的巨噬細(xì)胞通過NADH/NADPH氧化酶合成的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)活化NF-κB和MAPK信號通路導(dǎo)致肝臟損傷[13]。煙堿活化巨噬細(xì)胞表面的α7nAChR后，可以通過抑制TLR-4介導(dǎo)的NF-κB和MAPK信號通路來發(fā)揮抗炎作用，從而減輕NASH的炎癥反應(yīng)。

圖3　小鼠肝臟組織α7nAChR蛋白質(zhì)表達(dá)

理論依據(jù)。

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Reproduction and Genotype Identification of α7nAChR Knockout mice

LI Fu-qiang1，WU Xiao-cui1，CHEN Xiao-mei1，TANG Cui-lan2

1.TheSecondClinicalMedicalCollege，ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China;

2.DepartmentofInfectionsDisease，ZhejiangProvinceXinhuaHospital,Hangzhou310006,China.

Abstract:Objective:Reproduce and identify α7nAChR knockout mice. Methods:Heterozygote mice were bred and reproduced. Genome DNA was extracted from the murine tail and identified by PCR; Additionally, the expression of α7nAChR protein was detected by Western blot to further confirmed the reliability of PCR methods for genotype identification of α7nAChR mutant mice. Results:α7nAChR genotypes of the offspring mice included heterozygous (α7nAChR+/-),homozygous (α7nAChR-/-),and wild types(α7nAChR+/+).The homozygous rate of offspring was 30% .Conclusion: α7nAChR knockout mice are successful reproduced, which provides an ideal animal model for study of the NASH.

Key words:α7 nicotinic acetylcholine receptor; Knockout mouse; Nonalcoholic steatohepatitis

收稿日期：(2015-03-23)編輯：翟興英

中圖分類號：R285.5

文獻標(biāo)識碼：A

通信作者：**唐翠蘭(1971—)，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。TeL：15988115612，E-mail:1747603542@qq.com。