基于正交設(shè)計(jì)的不同針刺因素對(duì)皮質(zhì)酮腎陽(yáng)虛大鼠垂體-性腺軸的影響*

*基金項(xiàng)目: 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81360562)；江西省衛(wèi)計(jì)委中醫(yī)藥科研計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2014Z006) 。

**第一作者： 裴佳 (1990— )，女，2013級(jí)在讀研究生。

基于正交設(shè)計(jì)的不同針刺因素對(duì)皮質(zhì)酮腎陽(yáng)虛大鼠垂體-性腺軸的影響*

*基金項(xiàng)目: 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81360562)；江西省衛(wèi)計(jì)委中醫(yī)藥科研計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2014Z006) 。

**第一作者： 裴佳 (1990— )，女，2013級(jí)在讀研究生。

★裴佳1**程立紅2閔友江2***閔志云1丁李立強(qiáng)1張輝1(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院南昌 330006)

摘要：目的：探索影響針刺效應(yīng)的主次因素和針刺參數(shù)的最佳組合，以期為提高針刺療效、指導(dǎo)針灸臨床提供理論依據(jù)。方法：采用L9(34)正交表對(duì)影響針刺效應(yīng)的4因素(穴位的選擇、捻針角度、捻針頻率、捻針時(shí)間)3水平安排試驗(yàn)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)控制針刺手法儀治療腎陽(yáng)虛大鼠，通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)血清T、E2和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)垂體中LH、FSH mRNA表達(dá)的水平來比較上述4因素的主次。結(jié)果：上述4因素對(duì)針刺效應(yīng)的影響大小依次是穴位選擇、捻針角度、捻針頻率、捻針時(shí)間，其中腧穴的選擇是影響針刺效應(yīng)的重要因素(P<0.05)；捻針角度、捻針頻率和捻針時(shí)間是影響針刺效應(yīng)的次要因素(P>0.05)。結(jié)論：針刺治療腎陽(yáng)虛大鼠的最佳針刺參數(shù)為針刺腎俞穴，捻針角度為90°，頻率為60次/min，捻針60s；不同因素對(duì)針刺治療腎陽(yáng)虛大鼠的療效不同，其中穴位的選擇對(duì)療效的影響最大，其次為捻針角度，再次是捻針頻率，最次是捻針時(shí)間。

關(guān)鍵詞：正交設(shè)計(jì)；針刺因素；腎陽(yáng)虛

針灸是通過疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和陰陽(yáng)、扶正祛邪作用治療疾病的。其扶正祛邪的作用是通過針灸能產(chǎn)生補(bǔ)虛瀉實(shí)的效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。一般認(rèn)為針灸補(bǔ)虛瀉實(shí)的效應(yīng)與穴位的相對(duì)特異性、補(bǔ)瀉手法、機(jī)體的機(jī)能狀態(tài)、刺激量的大小等因素有關(guān)[1-4]。而刺激量的大小又與作用時(shí)間(行針時(shí)間、留針時(shí)間、針刺間隔時(shí)間、針刺次數(shù)或療程)和針刺強(qiáng)度(提插的幅度、捻轉(zhuǎn)的角度、提插捻轉(zhuǎn)的頻率、針具的粗細(xì)、針刺深淺)有關(guān)[3]。但對(duì)于針刺補(bǔ)瀉效應(yīng)與穴位的相對(duì)特異性、刺激量的關(guān)系如何？針刺刺激量能不能做到定量？影響針刺效應(yīng)的主次因素是什么？能否獲取最佳針刺效應(yīng)多因素的最佳組合？對(duì)于這些問題，有些學(xué)者[5-7]做過一些理論上的探討或?qū)嶒?yàn)研究，但存在一些不足之處。為進(jìn)一步客觀、科學(xué)、定量地研究針刺效應(yīng)與不同針刺因素的關(guān)系，本研究在皮質(zhì)酮腎陽(yáng)虛大鼠模型的基礎(chǔ)上采用L9(34)正交表對(duì)影響針刺效應(yīng)的4因素(穴位的選擇、捻針角度、捻針頻率、捻針時(shí)間)3水平安排試驗(yàn)，通過采用計(jì)算機(jī)控制針刺手法儀對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠進(jìn)行針刺效應(yīng)影響因素定性定量化實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)將研究闡述如下。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只SD大鼠，雄性，體重220g左右,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)(SCXK 2011-0003)，清潔級(jí)，飼料喂養(yǎng)。所有大鼠進(jìn)行飼養(yǎng)3d后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]進(jìn)行定穴，剪去穴位處的毛發(fā)。

1.2實(shí)驗(yàn)器材0.5寸30號(hào)華佗牌一次性針灸針(蘇州醫(yī)療器械廠生產(chǎn))；酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan MS公司生產(chǎn))；洗板機(jī)(Thermo Labsystems公司生產(chǎn))；移液器(Pipetman生產(chǎn))；計(jì)算機(jī)控制針刺手法儀(專利公開號(hào):CN1709215)，上海中醫(yī)藥大學(xué)研制；旋渦振蕩器(上海青浦瀘西儀器廠生產(chǎn))；手握式電動(dòng)勻漿機(jī)(德國(guó)FLUKO 公司生產(chǎn))；低溫冷凍離心機(jī)(Sigma公司生產(chǎn))；Real-time檢測(cè)儀：(ABI公司生產(chǎn))；超純水分離系統(tǒng)(美國(guó)LABCONCO公司生產(chǎn))。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑氫化可的松注射液(天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，5ml/25mg，H12020886)；T、E2酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(上海博谷生物科技有限公司生產(chǎn))；Trizol(invitrogen公司生產(chǎn))；DEPC處理水(基爾頓生物科技(上海)有限公司生產(chǎn))；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn))；SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司生產(chǎn))；RNaseⅠ(Fermentas公司生產(chǎn))。

1.4藥物對(duì)照組大鼠用藥及用藥劑量

1.4.1右歸丸配方(按《景岳全書》記載)：肉桂、制附子各6g，山茱萸、當(dāng)歸各9g，山藥、枸杞子、鹿角膠、杜仲、菟絲子各12g，熟地黃24g。全部藥材從江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房購(gòu)進(jìn)。煎煮方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]。

1.4.2用藥劑量：按70kg體重成年人每日1劑藥，每劑400mL煎劑計(jì)算，200g大鼠的右歸丸煎劑灌服用量換算公式[10]：大鼠日服總量=人日服總量(400mL)×大鼠與人體表面積比(0.018) =7.2mL。分兩次灌服。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素設(shè)計(jì)①因素A-針刺穴位選擇：根據(jù)前期工作基礎(chǔ)，選擇腎俞穴治療腎陽(yáng)虛證大鼠；選擇前三里作為對(duì)照穴位之一；非穴區(qū)，擬選擇前三里旁開5mm處的點(diǎn)，作為對(duì)照穴位之一。②因素B-捻針角度：綜合文獻(xiàn)和項(xiàng)目組成人員的臨床經(jīng)驗(yàn)，擬將捻針角度設(shè)定為360°、180°和90°三個(gè)水平。③因素C-捻針頻率：綜合文獻(xiàn)和項(xiàng)目組成人員的臨床經(jīng)驗(yàn)，擬將捻針頻率設(shè)定為180次/min、120次/min和60次/min三個(gè)水平。④因素D-捻針時(shí)間：綜合文獻(xiàn)和和前期研究，擬將每次捻針的時(shí)間設(shè)定為120s、60s和30s三個(gè)水平。見表1。

影響針刺效應(yīng)的因素有針刺穴位選擇、捻針角度、捻針頻率、捻針時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)在腎陽(yáng)虛大鼠模型的基礎(chǔ)對(duì)上述4因素3水平采用正交表安排試驗(yàn)。查統(tǒng)計(jì)表，選擇L9(34 )正交設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)。

2.2分組和造模60只SD雄性大鼠飼養(yǎng)3天后按體重查隨機(jī)表隨機(jī)分成2組，一組為8只，作為正常對(duì)照組；另一組為52只，用于實(shí)驗(yàn)造模。造模方法：每只大鼠以0.03mg/g劑量肌注射氫化可的松，每日1次，連續(xù)肌注10d。52只造模后的腎陽(yáng)虛大鼠，按體重查隨機(jī)表隨機(jī)分成11組，一組8只，作為模型對(duì)照組，另一組8只作為右歸丸治療對(duì)照組，其它9組作為實(shí)驗(yàn)組，每組4只。

2.3治療方法

表1　實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素具體設(shè)計(jì)方案

2.3.1采用自制的固定器捆綁大鼠，0.5寸30號(hào)的毫針刺入穴位5mm～7mm，進(jìn)針后稍稍提插捻轉(zhuǎn)，然后與針刺手法儀連接，按相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行針刺手法操作，留針10min，再手法操作1次，再留針10min，然后出針。設(shè)正常對(duì)照組，采用氫化可的松造模為模型組，按右歸丸配方煎藥灌胃作為藥物對(duì)照組，各組共治療14d。對(duì)照組大鼠進(jìn)行相同的捆綁。治療結(jié)束后處死動(dòng)物提取相應(yīng)的組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

2.4指標(biāo)檢測(cè)及方法

2.4.1治療方法標(biāo)本采集 治療結(jié)束第2d處死大鼠。抽取動(dòng)脈血，離心，取上清液，分裝，-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩囝^，用咬骨鉗咬掉顱骨，分離垂體，立即投入到液氮中速凍，然后放入-80℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2血清T、E2的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫方法測(cè)量其濃度，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.4.3 垂體LH、FSH mRNA表達(dá)的檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

2.4.3.1 組織總RNA的抽提按Trizol說明書操作。

2.4.3.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA 反應(yīng)體系為RNA-Primer Mix：12μL；5×RT Reaction Buffer：5μL；25mM dNTPs：1μL；25U/μL RNase Inhibitor：1μL；200U/μL M-MLV Rtase：1μL；Oligo(dt)18：1μL；ddH2O(DNase-free)：4μL?？傮w積：25μL。擴(kuò)增條件為37℃，60min；85℃，5min；4℃，5min；置于-20℃保存。

2.4.3.3Real-time PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增體系為SYBRGreen Mix：12.5μL；上游引物F：0.5μL；下游引物R：0.5μL；ddH2O：9.5μL；cDNA模板：2μL?？傮w積：25μL。擴(kuò)增條件為95℃，10min(95℃，15S；60℃，45Sec)×40；95℃,15 S； 60℃，1min；95℃,15 S；60℃, 15 S。引物的合成與純化均由上海捷瑞生物科技有限公司提供。LH上游引物序列為5'- GCTCGGAGGATGGCTCTTTT-3'，下游引物序列為5'- AGCACAGATGACGACGAAGG-3'； FSH上游引物序列為5'- TAAGGATGGCCTTGCTCCTG-3'，下游引物序列為5'- GCTTGGTGAGCACAAACCTC-3'。

2.4.3.4相對(duì)mRNA表達(dá)水平的計(jì)算數(shù)據(jù)分析采用ABI Prism 7300 SDS Software。每個(gè)樣品中靶基因的相對(duì)mRNA表達(dá)水平采用以下公式計(jì)算：相對(duì)mRNA表達(dá)=2-△Ct×100% ，其中△Ct =靶基因Ct值-管家基因Ct值。

3結(jié)果

造模的大鼠體重減輕，毛發(fā)失去光澤，弓背，扎堆，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，陰囊皺縮，尿量明顯增多；經(jīng)針刺和右歸丸治療后，大鼠食欲增加，體重加重，毛發(fā)漸漸有光澤，喜歡活動(dòng)，而模型對(duì)照組的大鼠整體情況不佳。

四個(gè)指標(biāo)在正常對(duì)照組與模型對(duì)照組之間比較，均具有極顯著性差異(P<0.01)；LH mRNA在藥物對(duì)照組與模型對(duì)照組之間比較，具有極顯著性差(P<0.05)，其它三個(gè)指標(biāo)在藥物對(duì)照組與模型對(duì)照組之間比較，均具有極顯著性差異(P<0.01)。說明采用右歸丸治療氫化可的松造模形成的腎陽(yáng)虛是有效的；通過大鼠一般情況的比較及以方測(cè)證的結(jié)果，說明采用氫化可的松造模方法是成功的。結(jié)果見表2。

表2　模型組分別與正常對(duì)照組和藥物對(duì)照組比較

注：與模型組比較，①P<0.01，②P<0.05；與藥物觀察組比較，③P<0.01，④P<0.05。由于LH、FSH mRNA檢測(cè)的數(shù)值較小，本文中LH、FSH mRNA 所有數(shù)值是×1000后的結(jié)果。

經(jīng)直觀分析，R值越大，針刺治療效果越好。對(duì)血清T水平的影響從大到小排列順序?yàn)椋貉ㄎ贿x擇、捻針角度、捻針時(shí)間、捻針頻率，最佳組合是A3B3C3D2；對(duì)血清E2水平的影響從大到小排列順序?yàn)椋貉ㄎ贿x擇、捻針時(shí)間、捻針頻率、捻針角度，最佳組合是A3B2C1D1；對(duì)垂體組織LH mRNA表達(dá)的影響從大到小排列順序?yàn)椋耗磲橆l率、捻針角度、捻針時(shí)間、穴位選擇，最佳組合是A2B3C2D2；對(duì)垂體組織FSH mRNA表達(dá)的影響從大到小排列順序?yàn)椋耗磲槙r(shí)間、捻針角度、捻針頻率、穴位選擇，最佳組合是A3B1C3D2，見表3。結(jié)合表4各因素對(duì)以血清T、E2水平和垂體LH、FSH mRNA表達(dá)影響的方差分析結(jié)果，即不同針刺因素影響針刺效應(yīng)主次的權(quán)重和每一針刺因素不同水平優(yōu)劣的權(quán)重，對(duì)針刺效應(yīng)的影響從大到小排列順序?yàn)椋貉ㄎ贿x擇、捻針角度、捻針頻率、捻針時(shí)間，最佳組合是A3B3C3D2，即針刺腎俞穴，捻針角度為90°，頻率為60次/min，捻針60s。

表3　4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及相關(guān)指標(biāo)極差分析

綜合分析結(jié)果，腧穴的選擇對(duì)血清E2水平、垂體FSH mRNA表達(dá)的影響是重要因素(P<0.05)，對(duì)血清T水平的影響是主要因素(P<0.01)，對(duì)垂體LH mRNA表達(dá)的影響是次要因素(P>0.05)；針刺捻針角度對(duì)血清T、E2水平及垂體LH mRAN表達(dá)的影響都是次要因素(P>0.05)，對(duì)垂體FSH mRAN表達(dá)的影響是主要因素(P<0.01)；捻針頻率對(duì)血清T、E2含量及垂體FSH mRNA表達(dá)的影響都屬于次要因素(P>0.05)，對(duì)垂體LH mRAN表達(dá)的影響是重要因素(P<0.05)；捻針時(shí)間對(duì)上述四個(gè)指標(biāo)的影響是次要因素(P>0.05)。根據(jù)不同因素主次的權(quán)重和每一因素不同水平優(yōu)劣的權(quán)重綜合分析，腧穴的選擇是影響針刺效應(yīng)的重要因素，而捻針角度、捻針頻率和捻針時(shí)間都是影響針刺效應(yīng)的次要因素，見表4。

4討論

臨床長(zhǎng)期大量使用腎上腺皮質(zhì)激素治療的病人停藥后表現(xiàn)為腎上腺皮質(zhì)功能低下出現(xiàn)腎陽(yáng)虛一系列癥狀。沈自尹院士[11]幾十年來的研究證實(shí)腎陽(yáng)虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)在于下丘腦-垂體-靶腺(腎上腺、甲狀腺、性腺)軸的功能低下。馬娜等[12]采用氫化可的松制作腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型，在肌注氫化可的松的同時(shí)于第8d開始用右歸丸治療，分別于第15、23、30d后采用放免法檢測(cè)大鼠血清中FSH、LH、T的含量，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠各期FSH、LH、T 水平均明顯下降，右歸丸治療能使低下的FSH、LH、T水平升高，但不同時(shí)期的作用有差異。劉天成等[13]用同樣的方法制作皮質(zhì)酮腎陽(yáng)虛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清T含量明顯降低，而右歸丸治療能顯著提高腎陽(yáng)虛大鼠血清T含量。楊廉等[14]研究發(fā)現(xiàn)溫針灸腎俞穴具有明顯調(diào)節(jié)性激素的作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清T、E2和垂體LH、FSH mRNA的表達(dá)分別明顯低于正常對(duì)照組，右歸丸治療后上述指標(biāo)都有不同程度的升高。另外不同針刺觀察組指標(biāo)的均值大部分介于模型組與正常組之間，針刺治療腎陽(yáng)虛證的作用機(jī)制可能是針刺能夠使功能低下的垂體-性腺軸功能趨于正常。

腎陽(yáng)虛證模型是中醫(yī)虛證實(shí)驗(yàn)研究中運(yùn)用得最多且比較成功的動(dòng)物模型之一。該動(dòng)物模型是依據(jù)臨床腎陽(yáng)虛患者腎上腺皮質(zhì)功能低下而設(shè)計(jì)的?；谇捌谘芯縖9]及按照陳英華等[15]提出的評(píng)價(jià)腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型從一般狀態(tài)與實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、客觀指標(biāo)、藥物反證幾個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)的科學(xué)設(shè)想，本實(shí)驗(yàn)采用氫化可的松肌肉注射制作腎陽(yáng)虛證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型；通過對(duì)大鼠進(jìn)行一般情況觀察、右歸丸治療反證、模型組血清T、E2和垂體LH、FSH mRNA的表達(dá)分別明顯低于正常對(duì)照組和右歸丸觀察組，表明模型是成功的。

本實(shí)驗(yàn)分別以血清T、E2和垂體LH、FSH mRNA的表達(dá)為觀察對(duì)象進(jìn)行方差分析結(jié)果表明，腧穴的選擇是影響針刺效應(yīng)的主要因素。對(duì)于腎陽(yáng)虛證來說，選擇腎俞穴的治療效果要好于前三里，好于非穴區(qū)。黃成等[16]研究發(fā)現(xiàn)艾灸或針剌老年大鼠“腎俞”，能增加其垂體及血清LH、FSH水平，因此認(rèn)為針灸可使老年大鼠低下的垂體內(nèi)分泌水平得到恢復(fù)。而前三里是手陽(yáng)明大腸經(jīng)的腧穴，與腎沒有直接的關(guān)系；從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分析，前三里與腎陽(yáng)虛證的靶腺(腎上腺、甲狀腺、性腺)也沒有直接的聯(lián)系。

表4　以血清T、E2水平和垂體LH、FSH mRNA的表達(dá)為觀察指標(biāo)的針刺多因素方差分析

而所選擇的非穴區(qū)更無(wú)上述相關(guān)聯(lián)系。因此，通過上述的分析與本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，腧穴主治作用還是有相對(duì)特異性的。

本實(shí)驗(yàn)分別以血清T、E2和垂體LH、FSH mRNA的表達(dá)為觀察對(duì)象進(jìn)行方差分析結(jié)果表明，針刺捻針角度、捻針頻率和捻針時(shí)間是影響針刺效應(yīng)的次要因素。捻針角度、頻率和時(shí)間是構(gòu)成針刺刺激量的主要要素，但針具的粗細(xì)也是構(gòu)成針刺刺激量的主要要素之一。至于針刺捻針角度、頻率、時(shí)間在本實(shí)驗(yàn)中處于次要因素的可能原因是針灸針對(duì)大鼠的刺激量太大，當(dāng)再進(jìn)行捻針時(shí)，其捻針的角度、頻率、時(shí)間所形成的針刺刺激量的累積，大鼠可能已經(jīng)不能感受。

本實(shí)驗(yàn)使用的計(jì)算機(jī)控制針刺手法儀只對(duì)針刺捻針的角度、頻率、時(shí)間進(jìn)行定量控制，本實(shí)驗(yàn)采用的計(jì)算機(jī)控制針刺手法儀還不能模擬針刺補(bǔ)瀉手法，針刺補(bǔ)瀉手法很可能與針刺取穴、捻針角度、頻率、時(shí)間存在交互作用，由于硬件和軟件等各方面的原因，補(bǔ)瀉手法沒有作為獨(dú)立因素進(jìn)行研究。

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Empirical Study on the Influences of Different Acupuncture Factors on Pituitary-gonad Axis in Hydrocortisone Rats with Kidney-YANG Deficiency Based on Orthogonal Design

PEI Jia1, CHENG Li-hong2, MIN You-jiang2, MIN Zhi-yun1, DING Li- li-qiang1, ZHANG Hui1

1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;

2.AffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China.

Abstract:Objective: To explore primary & secondary factors that influence acupuncture effectiveness and the best combination of acupuncture parameters, in order to provide experimental evidence to elevate acupuncture effectiveness for clinic application. Orthogonal design was adopted to study several factors that influence acupuncture effectiveness. The rats model of kidney-YANG deficiency made by hydrocortisone as the study objects. Methods: 4 influential factors (i.e. selection of acupoints, twisting-rotating angle, twisting-rotating frequency and acupuncture time) plus 3 levels of each factor were arranged to L9(34) orthogonal table. Treat kidney-YANG deficiency rats by computer controlled acupuncture manipulation device. Serum T and E2 were evaluated by ELISA method and pituitary LH and FSH mRNA expression by real time fluorescent quantitation PCR to illustrate the primary & secondary factors and the good & bad of different levels in each factor that could affect the acupuncture effectiveness. Results: Among 4 factors mentioned above, the order for influential factors from major to small is acupoints selection, twisting-rotating angle, twisting-rotating frequency and acupuncure time, among which, selection of acupoints was the major factors (P<0.05), twisting-rotating angle, twisting-rotating frequency and acupuncture time were the secondary factors (P>0.05,P>0.05 and P>0.05) .Conclusion : ①The best acupuncture parameters for treating kidney-YANG deficiency rats were: selecting Shenshu acupoint (B23), 90°of twisting-rotating angle, 60tpm of twisting-rotating frequency and 60s of acupuncture time;②In this study, different acupuncture parameter has different efficacy for kidney-YANG deficiency rats; among them, selection of acupoints became the biggest influential factor, the next was twisting-rotating angle, the secondary was twisting-rotating frequency, and the last one was acupuncture time.

Key words:Orthogonal design; Kidney-YANG deficiency; T;E2；LH; FSH

收稿日期：(2015-01-20)編輯：翟興英

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

通信作者：***閔友江，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師。研究方向：運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病針灸治療。Tel：13177788362；E-mail：myj2002@126.com。