局部注射淫羊藿苷對大鼠正畸致炎性牙根吸收的影響

周艷妮，袁學(xué)順，岳子琪，曹寶成

（1．蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科，甘肅蘭州 730000；2．武警甘肅總隊醫(yī)院口腔科，甘肅蘭州 730050）

正畸致炎性牙根吸收［1］（orthodontically induced inflammatory root resorption，OIIRR）是由于正畸力對牙骨質(zhì)的作用超過了其自身修復(fù)能力，多核破牙骨質(zhì)細(xì)胞侵襲牙根表面，形成吸收陷窩所致。研究認(rèn)為破牙骨質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)和功能上與破骨細(xì)胞相似［2］。淫羊藿作為補腎中藥之一，可抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟［3-4］。因此，本研究選擇淫羊藿苷，觀察其對大鼠正畸致牙根吸收是否存在治療作用。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 28只8周齡雄性SD大鼠（甘肅省中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供），體質(zhì)量（200±10）g，動物合格證號：SYXK（甘）2011-0001號。

1．1．2 實驗藥物 淫羊藿苷購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110737-200415（純度＞99%）。

1．1．3 主要試劑和儀器 TRAP試劑盒購自美國Sigma公司。恒溫箱（北京福意聯(lián)責(zé)任有限公司）；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；離子濺射儀（美國EMS公司）；Mimics圖像分析軟件10．0（比利時Materialise公司）；切片機、自動脫水機、石蠟包埋機（德國徠卡公司）；雙目光學(xué)顯微鏡（寧波舜宇公司）；照相系統(tǒng)（重慶奧特公司）。

1．2 方法

1．2．1 造模方法 參照LEIKER等［5］方法建立模型（圖1）。在28只大鼠的雙側(cè)上前牙唇、舌、遠(yuǎn)中三面和右側(cè)第一磨牙近遠(yuǎn)中面，用低速打磨機磨出0．2mm深凹槽。用結(jié)扎絲將鎳鈦拉簧固定在上頜右側(cè)第一磨牙的近中頰側(cè)，使用正畸測力計測定50g的拉力，將拉簧的另一端固定于上切牙凹槽內(nèi)，后用牙釉質(zhì)粘結(jié)劑粘結(jié)切牙牙面和結(jié)扎絲，表面打磨拋光。

圖1 大鼠正畸牙移動模型Fig．1 Rat models of orthodontic root movement

1．2．2 動物分組和給藥方法 將28只大鼠按隨機原則分為3組。淫羊藿苷組：14只大鼠右側(cè)上頜放置矯治器，并于當(dāng)天開始，每隔3d于右側(cè)上頜第一磨牙頰側(cè)按200mg／kg注射淫羊藿苷0．05mL；陽性對照組：14只大鼠右側(cè)上頜放置矯治器，每隔3d于右側(cè)上頜第一磨牙頰側(cè)注射等量生理鹽水0．05mL；陰性對照組：所有大鼠的左側(cè)上頜磨牙與上頜切牙間，既不安放矯治器也不注射任何藥物。

1．2．3 觀察牙根表面吸收陷窩 實驗第14天，淫羊藿苷組和陽性對照組隨機取7只大鼠，斷頸處死，分離雙側(cè)上頜第一磨牙。將標(biāo)本自然風(fēng)干24h。鈀金噴涂樣品（厚度50nm），場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察各組第一磨牙近中根的近中面。按照牙根吸收陷窩分為的3種分類［5］：孤立的小陷窩；廣而淺的陷窩；深及牙本質(zhì)的陷窩。用Mimics圖像軟件計算各組吸收陷窩面積及吸收陷窩率。牙根吸收陷窩率＝3類陷窩面積總和／牙根面積×100%。

1．2．4 牙周組織形態(tài)觀察 淫羊藿苷組和陽性對照組取另7只大鼠，在實驗第14天，通過中性甲醛心臟灌注后，取雙側(cè)上頜第一磨牙及其周圍牙槽骨的組織塊，固定24h，100g／L乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣10周，脫水、包埋。沿牙體長軸，按近遠(yuǎn)中方向連續(xù)切片5張，每張切片厚度4μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。100倍鏡下觀察上頜第一磨牙近中根受壓側(cè)的牙周組織變化；400倍鏡下觀察牙周組織內(nèi)多核破骨和破牙骨質(zhì)細(xì)胞。TRAP陽性細(xì)胞計數(shù)：在400倍鏡下，于上頜第一磨牙近中根近中側(cè)根中1／3牙周組織內(nèi)，隨機選擇5個視野，進(jìn)行TRAP陽性細(xì)胞計數(shù)。

1．3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17．0統(tǒng)計分析軟件，對各組吸收陷窩率用進(jìn)行χ2檢驗；對TRAP陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行組間單因素方差分析（ANOVA）檢驗，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 大鼠上頜第一磨牙近中根SEM觀察 陰性對照組：牙根表面光滑均勻；陽性對照組：牙根表面吸收陷窩多為廣而淺的陷窩和深及牙本質(zhì)的陷窩，且吸收陷窩面積大；淫羊藿苷組：牙根表面吸收陷窩多為孤立的小陷窩，吸收陷窩少于陽性對照組（圖2）。

圖2 各組大鼠上頜第一磨牙的SEM圖像Fig．2 The SEM image of rat maxillary first molar in the three groups

Mimics 10．0測量牙根吸收陷窩率，陰性對照組為0．07%，陽性對照組為24．03%，淫羊藿苷組為2．51%。陰-陽性組間和陽-淫羊藿苷組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05），陰-淫羊藿苷組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05，表1）。

表1 3組各類吸收陷窩面積的比較Tab．1 Comparison of lacuna area absorption of various types in the three groups （mm2）

2．2 大鼠上頜第一磨牙近中根的近中面HE染色100倍鏡下：陰性對照組牙骨質(zhì)表面少見吸收陷窩，近中側(cè)牙周膜均勻。陽性對照組牙骨質(zhì)層連續(xù)性破壞，吸收陷窩較多，且多在受壓側(cè)根中1／3處；受壓側(cè)牙周膜變窄，出現(xiàn)透明區(qū)，牙槽骨吸收呈不規(guī)則形態(tài)。淫羊藿苷組：牙骨質(zhì)和牙槽骨的吸收陷窩少于陽性對照組；牙周膜少見透明區(qū)。400倍鏡下：陰性對照組的牙周組織內(nèi)罕見多核細(xì)胞。陽性對照組牙根表面的吸收陷窩和淺掘性吸收陷窩內(nèi)，有一定數(shù)量的多核破牙骨質(zhì)細(xì)胞，牙槽骨內(nèi)有大量的多核破骨細(xì)胞。淫羊藿苷組牙周組織內(nèi)多核細(xì)胞數(shù)量少于陽性對照組（圖3）。

2．3 TRAP染色大鼠上頜第一磨牙近中根的近中面TRAP染色用于確定破骨細(xì)胞和破牙骨質(zhì)細(xì)胞，受壓側(cè)牙根表面的破牙骨質(zhì)細(xì)胞和牙槽骨內(nèi)的破骨細(xì)胞均為TRAP陽性細(xì)胞。400倍鏡：陰性對照組鮮見TRAP染色陽性細(xì)胞；淫羊藿苷組和陽性對照組的牙槽骨內(nèi)TRAP陽性明顯多于牙根表面。淫羊藿苷組的TRAP陽性細(xì)胞數(shù)顯著少于陽性對照組（圖4）。各組間TRAP陽性細(xì)胞數(shù)：陰性對照組為0．6±0．3，陽性對照組為8．0±3．8，淫羊藿苷組為4．2±3．2，各組間均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）。

圖3 各組上頜第一磨牙近中根HE染色的病理學(xué)改變Fig．3 Pathological changes of maxillary first molar root HE staining in the three groups

圖4 各組上頜第一磨牙近中根TRAP染色的病理學(xué)改變Fig．4 Pathological changes of maxillary first molar root TRAP staining in the three groups（×400）

3 討 論

OIIRR是正畸治療常見的并發(fā)癥之一，其較高的發(fā)生率以及對正畸療效的不良影響引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。OIIRR發(fā)生機制為在矯治力作用下，壓力側(cè)局部組織發(fā)生變性、壞死。正畸牙移動造成無菌性炎癥，這些無菌性壞死組織產(chǎn)生的信號會激活壞死區(qū)的清除活動。最先的是透明區(qū)外周的組織，在清除透明區(qū)時，表面覆蓋著類牙骨質(zhì)的牙骨質(zhì)細(xì)胞層受損，使牙根表面下礦化牙骨質(zhì)暴露。

以往針對中藥作用的動物實驗多采用的是灌胃法［7］。本研究考慮到在口腔治療中，局部注射法局部血藥濃度高且較為便捷，因此根據(jù)大鼠灌胃劑量［8］，確定本實驗劑量為200mg／kg。

目前在OIIRR的治療方面，研究的藥物多為西藥，其中以治療骨質(zhì)疏松藥物雙磷酸鹽類居多［9-11］。該藥可和骨質(zhì)羥基磷灰石緊密結(jié)合，抑制骨吸收；可激活鈣化組織，選擇性的內(nèi)化參與骨吸收的破骨細(xì)胞［12］，破骨細(xì)胞失去骨吸收能力，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，從而抑制OIIRR。淫羊藿也是一種治療骨質(zhì)疏松的常用中藥，對骨髓系統(tǒng)的作用有以下幾方面：①可上調(diào)BMP-2（骨形成蛋白-2）、BMP-4（骨形成蛋白-4）和Cbfα1（成骨細(xì)胞核心結(jié)合因子α1）基因的表達(dá)從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化［13-14］；②可使破骨細(xì)胞β-肌動蛋白mRNA的表達(dá)量明顯下調(diào)，抑制破骨細(xì)胞β-肌動蛋白的產(chǎn)生，進(jìn)而干擾破骨細(xì)胞細(xì)胞骨架的形成和移動、粘附等功能，抑制破骨細(xì)胞的生成及骨吸收功能［15］；③ 可明顯抑制 RANKmRNA 的表達(dá)，下調(diào)RANK的表達(dá)，作用于RANK介導(dǎo)的核因子-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制破骨細(xì)胞分化成熟及骨吸收功能［4］；④可使破骨細(xì)胞生成數(shù)量均明顯減少，破骨細(xì)胞的凋亡率增加，骨吸收陷窩數(shù)目、面積均有減少，并具有劑量依賴性［16］；⑤可下調(diào)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞MMP-9mRNA的表達(dá)，而MMP-9是參與破骨細(xì)胞骨吸收的重要蛋白酶［17］?；谝陨弦罁?jù)，本實驗通過局部注射淫羊藿苷，探討其對正畸致炎性牙根吸收的影響。

在OIIRR動物實驗中，用SEM觀察離體牙仍然是客觀而可靠的。OIIRR的吸收陷窩分為3類［6］：①散在的小陷窩，可能是單個細(xì)胞活動造成，或是單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞和／或纖維細(xì)胞聚集的結(jié)果［6］，正常牙根表面的小吸收陷窩，是近牙槽骨骨皮質(zhì)的牙周膜和牙根表面間歇性受損引起的［18］；②廣而淺的陷窩；③深及牙本質(zhì)的陷窩，是巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞吸收牙根表面，通過分泌破骨細(xì)胞活化因子和前列腺素等物質(zhì)，吸引和激活具有較高的吞噬能力的碎屑細(xì)胞。碎屑細(xì)胞會很快侵犯暴露的礦化牙齒組織。雖然SEM可以清楚地觀察牙根表面的吸收情況，但在吸收深度上只能觀察牙骨質(zhì)最多到牙本質(zhì)層，而且樣品在做SEM前，要去除牙根周圍的軟組織，為判明牙周軟組織和吸收陷窩內(nèi)的細(xì)胞類型，還需用組織切片染色法。壞死組織的清除、鄰近的牙根表層組織的吸收或是機械力直接損傷牙根表層，使其下方高度礦化的牙骨質(zhì)暴露［19］。同時，破牙骨質(zhì)細(xì)胞以胞吐方式排出酸性水解酶，降解膠原性和非膠原性有機質(zhì)，已被破壞的根面將吸引更多的破牙骨質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行根吸收活動。至此牙骨質(zhì)的礦物質(zhì)和有機質(zhì)降解，形成吸收陷窩［20］。淫羊藿苷組HE染色示，牙根表面吸收陷窩較陽性對照組少，牙周組織的透明變性區(qū)也較少，說明淫羊藿苷減緩了牙根吸收的進(jìn)程。TRAP是破骨細(xì)胞的特異性標(biāo)志酶，可形成不溶性紅色沉淀于破骨細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)，有助于了解生理和病理條件下的骨代謝狀況。本實驗結(jié)果顯示，TRAP陽性細(xì)胞在牙槽骨處多于牙根表面，表明牙槽骨吸收較牙根更快。陰性對照組TRAP陽性細(xì)胞很少，說明在生理狀態(tài)下，大鼠上頜第一磨牙內(nèi)可見少量破骨細(xì)胞活動，但罕見破牙骨質(zhì)細(xì)胞。這可能與牙骨質(zhì)表面覆蓋類牙骨質(zhì)層，該層可不斷沉積，很少被破牙骨質(zhì)細(xì)胞吸收并可延遲吸收進(jìn)程。淫羊藿苷組TRAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于陽性對照組，說明淫羊藿苷減少了受壓側(cè)牙周組織內(nèi)的破骨和破牙骨質(zhì)細(xì)胞，這與HE染色觀察結(jié)果相一致。

本實驗結(jié)果表明，局部注射淫羊藿苷有利于抑制正畸致炎性牙根吸收的發(fā)生，但同時淫羊藿苷與其他具有相同作用的藥物一樣，也會輕度減少正畸牙齒的移動量［9，19］。同時面對正畸診療主體的青少年，淫羊藿是否會影響其正常發(fā)育，相關(guān)研究較少。因此，如何克服淫羊藿對牙齒正常移動量的不利影響以及是否存在安全性的問題還需要進(jìn)一步探討。

［1］KILLIANY DM．Root resorption caused by orthodontic treatment：An evidence-based review［J］．Semin Orthod，1999，5：128-133．

［2］OSHIRO T，SHIBASAKI Y，MARTIN TJ，et al．Immunolocalization of vacuolar-type H＋-ATPase，cathepsin K，matrix metalloproteinase-9，and receptor activator of NF kappaB ligand in odontoclasts during physiological root resorption of human deciduous teeth［J］．Anat Rec，2001，264（3）：305-311．

［3］張秀珍，楊黎娟．淫羊藿苷對大鼠成骨細(xì)胞護(hù)骨素、RANKL表達(dá)的影響［J］．中華內(nèi)分泌與代謝雜志，2006，22（3）：222-225．

［4］仙靈骨葆膠囊預(yù)防激素性股骨頭壞死43例［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2011，46（2）：289-291．

［5］LEIKER BJ，NANDA RS，CURRIER GF，et al．The effects of exogenous prostaglandins on orthodontic tooth movement in rats［J］．Am J Orthod Dentofacial Orthop，1995，108（4）：380-388．

［6］MAVRAGANI M，AMUNDSEN OC，SELLISETH NJ，et al．Early root alterations after orthodontic force application studied by light and scanning electron microscopy［J］．Eur J Orthod，2004，26：119-128．

［7］WU JF，DU J，XU CQ，et al．Icariin attenuates socialdefeatinduced down-regulation of glucocorticoid receptor in mice［J］．Pharmacol Biochem Behav，2011，98：273-278．

［8］謝瑾玉，董競成，崔焱．淫羊藿對哮喘大鼠肺組織RANTES及MCP-3表達(dá)的影響［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，28（3）：238-243．

［9］FUJIMURA YJ，KITAURA H，YOSHIMATSU M，et al．Influence of bisphosphonates on orthodontic tooth movement in mice［J］．Eur J Orthod，2009，31：572-577．

［10］CHOI J，BAEK SH，LEE JI，et al．Effects of clodronate on early alveolar bone remodeling and root resorption related to orthodontic forces：A histomorphometric analysis［J］．Am J Orthod，2010，138：548．e1-e8．

［11］PUTRANTO R，OBA Y，KANEKO K，et al．Effects of bisphosphonates on root resorption and cytokine expression during experimental tooth movement in rats［J］．Orthodontic Waves，2008，69：141-149．

［12］FRITH JC，MONKKONEN J，Auriola S，et al．The molecular mechanism of action of the antiresorptive and antiinflammatory drug clodronate：evidence for the formation in vivo of a metabolite that inhibits bone resorption and causes osteoclast and macrophage apoptosis［J］．Arthritis and Rheumatism，2001，44：2201-2210．

［13］何偉，李自力，崔元璐，等．淫羊藿苷對大鼠成骨細(xì)胞核結(jié)合因子α1、骨形成蛋白-2、骨形成蛋白-4 mRNA表達(dá)的影響［J］．北京大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2009，41（6）：669-673．

［14］錢衛(wèi)慶，尹宏，孫海濤．不同濃度淫羊藿苷對大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化的影響［J］．中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，36（8）：23-25．

［15］張大威，程巖，張金超，等．淫羊藿苷對破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能的影響［J］．中國藥理學(xué)通報，2007，23（4）：463-467．

［16］李晶晶，于世鳳，李鐵軍，等．淫羊藿對口腔各礦化組織破骨細(xì)胞性骨吸收的體外實驗研究［J］．中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2002，37（5）：391-395．

［17］劉興炎，呂明坡，葛寶豐，等．淫羊藿苷對小鼠破骨細(xì)胞β-肌動蛋白、抗酒石酸酸性磷酸酶、核因子-κB受體活化因子mRNA表達(dá)的影響［J］．中華實驗外科雜志，2007，24（8）：996-998．

［18］HELLSING E，HAMMARSTR?M L．The hyaline zone and associated root surface changes in experimental orthodontics in rats：a light and scanning electron microscope study［J］．Eur J Orthod，1996，18：11-18．

［19］ABASS SK，HARTSFIELD JK．Orthodontics and external apical root resorption［J］．Semin Orthod，2007，13：246-256．

［20］OWNLAN-MOLL P，KUROL J．The early reparative process of orthodontica induced root resorption in adolescents-location and type of tissue［J］．Eur J Orthod，1998，20（6）：727-732．