TNF-α基因-308位點(diǎn)多態(tài)性與新疆維吾爾族、哈薩克族人群中支氣管哮喘的關(guān)系

朱 佳，李忠凱，凌 敏

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸二科，新疆烏魯木齊 830000）

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）是一種由多種炎性細(xì)胞因子參與的慢性非特異性炎癥疾病。目前，公認(rèn)的觀點(diǎn)是該病的發(fā)生、發(fā)展可能與遺傳因素，環(huán)境因素及其相互作用有關(guān)，且具有家族聚集傾向和種族地域差異性［1-2］。

TNF-α基因是多功能細(xì)胞因子，其多態(tài)性與TNF-α的功能相關(guān)，且可能會影響其轉(zhuǎn)錄水平［3］，進(jìn)而影響疾病的發(fā)展和預(yù)后。TNF-α基因序列分析顯示，其上游調(diào)控區(qū)的-308位點(diǎn)存在堿基G-A的轉(zhuǎn)換［4］。關(guān)于TNF-α基因多態(tài)性與BA相關(guān)性的研究結(jié)論并不相同。崔麗英［5］和楊劍等［6］在新疆維吾爾族和漢族人群中研究發(fā)現(xiàn)TNF-α基因多態(tài)性與支氣管哮喘無相關(guān)性。而李瑩［7］和高金明等［8］在青島地區(qū)漢族人群及中國北方人群研究發(fā)現(xiàn)二者存在相關(guān)性，這與WINCHESTER［9］及崔天盆等［10］在愛爾蘭人群中兒童及澳大利亞兒童中的研究一致。提示TNF-α基因多態(tài)性與BA易感性在不同人群中的作用機(jī)制有可能不同，有必要進(jìn)一步研究不同人群與BA的易感性。

新疆地區(qū)各民族居住相對集中和固定，在許多地域還保留著世代完整的遺傳隔離群，遺傳學(xué)資源十分豐富，是研究少數(shù)民族基因多態(tài)性的理想?yún)^(qū)域。目前，關(guān)于TNF-α基因-308位點(diǎn)的多態(tài)性與新疆哈薩克族、維吾爾族人群支氣管哮喘易感性的研究尚未見報道。本研究以新疆哈薩克族、維吾爾族人群為研究對象，分析支氣管哮喘組與對照組TNF-α基因-308位點(diǎn)的基因型分布特征，以探討TNF-α基因多態(tài)性與新疆維吾爾族、哈薩克族人群BA易感性的關(guān)系。

1 對象與方法

1．1 研究對象 在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸科門診或住院治療的新疆維吾爾族及哈薩克族BA患者中各收集60例，均符合《支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)診治指南》標(biāo)準(zhǔn)［11］，其中維吾爾族BA組：男性32例，女性28例，平均年齡（54．3±15．1）歲；哈薩克族BA組：男性29例，女性31例，平均年齡（54．5±12．2）歲；同時選取本院健康體檢者維吾爾族60例和哈薩克族60例為對照組，4組之間年齡、性別比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05），具有可比性；排除標(biāo)準(zhǔn)：有嚴(yán)重的心、腦、肝、腎等疾病；高血壓、糖尿病、免疫系統(tǒng)疾病等與HLA相關(guān)疾病及有家族史者；近1個月內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑者；哮喘持續(xù)狀態(tài)危重患者或資料收集不全者。

4組對象均為無民族間遺傳干擾、無血緣關(guān)系的連續(xù)兩代及以上長期居住于新疆的維吾爾族、哈薩克族人群，所有受試者均簽署書面的志愿書，該研究由本單位的倫理委員會批準(zhǔn)。

1．2 研究方法 ①標(biāo)本采集：在清晨空腹時采集研究對象的靜脈血2mL，EDTA抗凝，上下顛倒混勻，-20℃低溫保存。②基因組DNA提?。豪萌蚪MDNA快速提取試劑盒（離心柱型），按照廠家提供的說明書提取全血基因組DNA。提取的DNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。③引物合成：參照SAKAO等［3］設(shè) 計 的 引 物，上 游 引 物：5′-AGGCAATAG-GTTTTGAGGGCCAT-3′，下游引物：5′-GAGCGTCTGCTGGCTGGGTG-3′。④PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系（35μL）：10mmol／L dNTP混合物2μL，10×Tap Buffer 3．5μL，2UTapDNA聚合酶，10μmol／L上下游引物各1μL，超純水補(bǔ)足至35μL。所用試劑及引物均購置于北京鼎國生物工程公司。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，63℃退火40s以及72℃延伸60s共35個循環(huán)；然后72℃延伸10min，最后4℃保存。10g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增出目的條帶的質(zhì)量。⑤測序：PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由北京鼎國生物工程公司進(jìn)行反向測序。測定結(jié)果出現(xiàn)雙峰，即為該位點(diǎn)的雜合子（AG型）型，出現(xiàn)單峰則為純合子型（AA型或GG型）。

1．3 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，各組間基因型和等位基因頻率的比較以及Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的吻合度檢驗采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗；多因素調(diào)整采用Logistic回歸分析，計算比值比（odds ratios，OR）和95%可信區(qū)間（confidence intervals，CI）用來檢測 TNF-α基因-308位點(diǎn)多態(tài)性和BA的相關(guān)性。所有統(tǒng)計均為雙側(cè)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果 根據(jù)測序結(jié)果，統(tǒng)計實驗個體中的AA型、AG型和GG型，經(jīng)卡方檢驗后發(fā)現(xiàn)研究對象處于Hardy-Weinberg平衡（P＞0．05），說明本研究采用的研究對象具有群體代表性，可以反映整體維吾爾族、哈薩克族人群基因的分布情況。

2．2 測序結(jié)果及基因型的判定 測序結(jié)果顯示，TNF-α基因-308位點(diǎn)存在GG、GA和AA 3種基因型，如圖1所示。

2．3 TNF-α基因-308位點(diǎn)的基因型和等位基因的分布 根據(jù)測序結(jié)果，統(tǒng)計TNF-α基因-308位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率（表1）。

2．4 TNF-α基因-308位點(diǎn)的基因型及等位基因與BA易感性的關(guān)系 以研究對象是否患BA為因變量經(jīng)Logistic回歸分析（協(xié)變量包括年齡、性別、GG、GA、AA基因型），經(jīng)調(diào)整年齡、性別后，維吾爾族及哈薩克族BA組A等位基因頻率均高于對照組，可能與BA的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)（OR＝0．182，95%CI＝0．083～0．398；OR＝0．399，95%CI＝0．195～0．816），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。提示A等位基因可能是BA的危險因素，可從基因水平上解釋個體間BA易感性存在差異（表2）。

圖1 新疆維吾爾族、哈薩克族人群中TNF-α基因-308位點(diǎn)的測序結(jié)果Fig．1 TNF alpha gene-308polymorphism of the sequencing results among Xinjiang Uighur and Kazakh

表1 TNF-α基因-308多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因的分布Tab．1 TNF alpha gene-308polymorphic loci of the distribution of genotype and allele ［n（%）］

表2 TNF-α基因-308位點(diǎn)的基因型和等位基因與BA易感性的關(guān)系Tab．2 Relationship of genotypes and alleles of TNF alpha gene-308loci with BA susceptibility

2．5 不同人群BA組和對照組TNF-α-308位點(diǎn)A等位基因頻率的分布比較 如表3所示，TNF-α-308位點(diǎn) A 等位基因頻率在土耳其人群［17］、蒙古族［5］、漢族［5］、新疆維吾爾族［6］人群BA組和對照組比較均無顯著性差異（P＞0．05），TNF-α-308位點(diǎn) A等位基因頻率在韓國人群［2］、本研究維吾爾族及哈薩克族中A等位基因頻率在兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05），與BA的發(fā)生存在相關(guān)性。

表3 不同人群TNF-α基因-308位點(diǎn)的A等位基因與BA易感性的關(guān)系Tab．3 Relationship of A alleles of different groups of TNF alpha gene-308loci with BA susceptibility （%）

3 討 論

BA是由多種細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等參與的慢性氣道炎癥。近幾年，BA的發(fā)病率逐年升高，尤其是北方地區(qū)，風(fēng)沙、花粉、冷空氣等對易感人群的刺激，使BA的發(fā)病率有持續(xù)增高的趨勢。因此，國內(nèi)外對其發(fā)病機(jī)制及其防治的研究成為目前研究的熱點(diǎn)［12］。目前，關(guān)于TNF-α基因-308多態(tài)性與BA相關(guān)性的研究中，不同種族的分析結(jié)果并不一致，有必要繼續(xù)對其他種族TNF-α基因-308多態(tài)性與BA的關(guān)系進(jìn)行研究，以確定其在BA發(fā)生和發(fā)展中的作用。

新疆維吾爾族、哈薩克族人群至今仍保留有相對完整的隔離遺傳體系，是進(jìn)行復(fù)雜疾病分子流行病學(xué)研究的理想人群。本研究結(jié)果顯示在維吾爾族、哈薩克族人群BA組和對照組中，TNF-α基因-308位點(diǎn)均以GG基因型多見；BA組GA基因型和A等位基因的頻率均高于對照組，且兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。A等位基因可能是BA的危險因素，攜帶GA和AA基因型患者發(fā)病風(fēng)險較高，提示TNF-α基因-308多態(tài)性與新疆維吾爾族、哈薩克族BA的易感性有關(guān)。

本研究與崔天盆等［10］在澳大利亞兒童中的研究與姜曉萍［13］及翟芝芳等［14］在黑龍江人群和山東地區(qū)漢族人群中研究一致：TNF-α基因-308多態(tài)性與BA的發(fā)病相關(guān)。而與 LOUIS［15］、SHIN［16］及 AYTEKIN等［17］分別對白種人、韓國人群、土耳其人群的研究結(jié)果相反，未發(fā)現(xiàn)與之有關(guān)。這說明TNF-α-308位點(diǎn)在不同人群中的作用機(jī)制或?qū)A的影響不同，可能與人種、民族或地域等差異有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，可通過檢測TNF-α-基因啟動子區(qū)-308位點(diǎn)的基因型來評估維吾爾族、哈薩克族人群患BA的風(fēng)險程度。因此，TNF-α-308A等位基因在臨床上可作為遺傳性標(biāo)記進(jìn)行檢測，在一定程度上發(fā)現(xiàn)和預(yù)防BA的高危人群。在今后的研究中，應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，研究不同人群的易感基因，為最終揭示BA發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，控制BA的發(fā)生提供更多的科學(xué)依據(jù)；也為研究維吾爾族、哈薩克族人群中與TNF-α基因多態(tài)性相關(guān)的其他疾病提供了基礎(chǔ)。

［1］賈南，管立學(xué)，李海波，等．TNF-α基因-308G／A多態(tài)性與兒童哮喘的相關(guān)性研究［J］．濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，34（6）：455-457．

［2］KIM HB，KANG MJ，LEE SY，et al．Combined effect of tumour necrosis factor-a and interleukin-13 polymorphisms on bronchial hyperresponsiveness in Korean children with asthma［J］．Clin Exp Allergy，2008，38（5）：774-780．

［3］SEVENOAKS MJ，STOCKLEY RA．Chronic obstructive pulmonary disease inflammation and co-morbidity：a common inflammatory phenotype？［J］．Respir Res，2006，7：70．

［4］SAKAO S，TATUSUMI K，IGARI H，et al．Association of tumor necrosis factor-alpha gene promoter polymorphism with the presence of chronic obstructive pulmonary disease［J］．Am J Respir Crit Care Med，2001，163（2）：420-422．

［5］崔麗英，王宏英．內(nèi)蒙古地區(qū)蒙漢族人群TNF-α基因多態(tài)性與支氣管哮喘的相關(guān)性［J］．內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)學(xué)報，2010，32（4）：354-357．

［6］楊劍，李風(fēng)森，蘇軍，等．新疆漢族、維吾爾族支氣管哮喘患者TNF-α基因-308位點(diǎn)的多態(tài)性與中醫(yī)證型相關(guān)性研究［J］．世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2013，3（15）：586-590．

［7］李瑩，紀(jì)霞，王海燕，等．青島地區(qū)支氣管哮喘患者TNF-α基因rs1800629位點(diǎn)多態(tài)性與表達(dá)及TNF-α、內(nèi)皮素相關(guān)性研究［J］．中華哮喘雜志，2013，4（7）：89-94．

［8］高金明，林耀光，邱長春，等．腫瘤壞死因子α及淋巴毒素α基因多態(tài)性和支氣管哮喘患者的關(guān)系［J］．中華結(jié)核與呼吸雜志，2002，7（25）：444-445．

［9］WINCHESTER EC，MILLWOOD IY，RAND L，et al．Association of the TNF-alpha-308 （G-A）polymorphism with selfreported history of childhood asthma［J］．Hum Genet，2000，107：591-596．

［10］崔天盆，吳健民．支氣管哮喘基因研究進(jìn)展［J］．國外醫(yī)學(xué)臨床生物學(xué)化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，2003，24（5）：270-271．

［11］中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組．中國支氣管哮喘防治指南（基層版）［J］．中華結(jié)核與呼吸雜志，2013，5（26）：331-336．

［12］孫鈺鋒，常曉悅，孫偉晶．TLR4和TNF-α基因多態(tài)性與支氣管哮喘的相關(guān)性研究［J］．臨床肺科雜志，2013，4（18）：662-664．

［13］姜曉萍，曹鋒林，王文寶，等．腫瘤壞死因子的基因型與支氣管哮喘的相關(guān)性［J］．黑龍江醫(yī)學(xué)，2002，26（5）：330-331．

［14］翟芝芳，李玉．腫瘤壞死因子-α基因多態(tài)性與支氣管哮喘相關(guān)性研究［J］．山東醫(yī)藥，2004，44（25）：4-6．

［15］LOUIS R，LEYDER E，MALAIS M，et al．Lack of association between adult asthma and the tumor necrosis factor alpha-308 polymorphism gene［J］．Eur Respir，2000，16（4）：604-608．

［16］SHIN HD，PARK BL，KIM LH，et al．Association of tumor necrosis factor polymorphism with asthma and serum total IgE［J］．Hum Mol Genet，2004，13（4）：397-403．

［17］AYTEKIN C，DOGO F，IKINCIOGULLARI A，et al．TGFBeta l-915G／T and TNF-alpha-308G／A polymorphisms in children with asthma［J］．Tu-berk Toraks，2009，57（1）：62-67．