一氧化氮合酶在胃食管反流病患者食道黏膜的表達(dá)

郭曉燕，王 婷，董 蕾，秦 斌，姜 炅，任春蓉

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710004）

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是消化系統(tǒng)的一種常見病，近年的流行病學(xué)調(diào)查顯示亞洲地區(qū)GERD的癥狀和反流性食管炎的流行率較以往普遍升高［1-2］。GERD的發(fā)病與多因素有關(guān)，目前認(rèn)為主要因素是胃食管連接部抗反流屏障結(jié)構(gòu)和（或）功能障礙以及食管防御功能進(jìn)行性喪失［3］。一氧化氮（NO）可調(diào)節(jié)食管括約肌的張力，其增多使括約肌松弛，其減少使括約肌收縮。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）分布的量和活性可直接影響到NO的形成和作用［4］。nNOS與神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)，iNOS與炎性介質(zhì)有關(guān)。國(guó)內(nèi)外目前少有報(bào)道GERD患者的中食管下段黏膜組織nNOS、iNOS密度變化、活性及mRNA表達(dá)是否有差異。本課題從蛋白和基因水平同時(shí)研究其表達(dá)，旨在探討GERD發(fā)生中NO相關(guān)分子發(fā)生的變化，為臨床開拓新的治療方法提供更確切的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 對(duì)象與材料 選取2007年10月至2010年3月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科門診就診的12例非糜爛性反流?。∟ERD）、13例反流性食管炎（RE）和8例健康對(duì)照。NERD的診斷標(biāo)準(zhǔn)為有胃食管反流癥狀但內(nèi)鏡下無反流性食管炎表現(xiàn)者。RE以國(guó)際公認(rèn)的胃鏡下反流性食管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)（洛杉磯分類法）選取，均符合以下條件：有反酸、燒心等典型癥狀；經(jīng)胃鏡檢查除外消化性潰瘍和腫瘤等器質(zhì)性疾病，無明顯的胃及十二指腸炎癥；無腹部手術(shù)史；無肝膽疾病及嚴(yán)重的全身疾病，無結(jié)締組織病和糖尿病病史。此外，由于吸煙、飲酒、肥胖、幽門螺桿菌感染等因素均參與了GERD的發(fā)生，所以入選對(duì)象均為非肥胖者、無吸煙、飲酒等不良習(xí)慣，無幽門螺桿菌感染史。正常對(duì)照組選取無反酸、燒心等癥狀，無免疫疾病、感染疾病病史，胃鏡下食管下段黏膜無明顯病變的功能性消化不良患者。所有研究對(duì)象均知情同意，并且本研究獲得西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

PENTAX電子胃鏡由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科提供；兔抗人NOS-1（nNOS）多克隆抗體和兔抗人NOS-2（iNOS）多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)公司。免疫組化二抗購(gòu)自中杉金橋公司，Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司，免疫組化染色圖像采集使用Aristoplan Q570C圖像分析儀（萊卡公司）。

1．2 標(biāo)本取材 內(nèi)鏡檢查由同一位熟練的內(nèi)鏡醫(yī)師按操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行?；顧z方法：經(jīng)胃鏡活檢孔活檢齒狀線上方4塊食管黏膜組織，RE于病變明顯部位多點(diǎn)取材，所取組織中2塊立即用100mL／L甲醛固定4h后行HE染色及免疫組化實(shí)驗(yàn)，另2塊組織立刻放入液氮速凍30min后放入-70℃冰箱保存待用。

1．3 食道黏膜的HE染色 將標(biāo)本制備蠟塊，連續(xù)切片，片厚3～5μm，常規(guī)脫蠟、水化后→蘇木素液染色5min→自來水沖洗蘇木素至返藍(lán)→去離子水浸泡2min→伊紅液染色30s→800mL／L乙醇1min→950mL／L乙醇Ⅰ3min，2次→無水乙醇5min，2次→二甲苯3min，2次→中性樹膠封固。染色結(jié)果：細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)、黏膜肌層呈深淺不一的紅色。經(jīng)病理學(xué)專家鑒定選取各組符合診斷條件的標(biāo)本行免疫組化分析。

1．4 食道黏膜組織nNOS、iNOS免疫組化染色 所取食道黏膜石蠟包埋組織行4～5μm連續(xù)切片，58℃電熱恒溫干燥箱過夜，脫蠟至水，梯度乙醇水洗，30mL／L過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，室溫置10min，PBS沖洗，高壓鍋120℃修復(fù)4min，PBS沖洗，滴加一抗（一抗?jié)舛葹?∶100），37℃水浴2h，PBS沖洗，滴加生物素化二抗，37℃水浴1h，PBS沖洗，室溫下DAB顯色，蘇木精復(fù)染，明膠封片。采用Image pro plus 6．0軟件進(jìn)行免疫組化表達(dá)強(qiáng)弱的判定分析。

1．5 Real-time PCR檢測(cè) 按說明書要求提取RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，―80℃保存待用。并用Nano DropND-1000分光光度計(jì)測(cè)定含量和純度，根據(jù)測(cè)定RNA含量結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。并按說明書要求合成cDNA并進(jìn)一步行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以NCBI GenBank中提供的人類基因序列行NOS引物 設(shè) 計(jì)，序 列 為 nNOS-P1，5′-AGCCGAGGCCAAAAACTGAGAA-3′，nNOS-P2，5′-AATGGGGAGAAATTCGGCTGTG-3′，iNOS-P1，5′-TTCCACGTTGGCAGGGTCCC-3′，iNOS-P2，5′-GATGCCCGCAGGTGTTCCA-3′。內(nèi)參基因采用β-actin，序列為 Forward Primer 5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，Reverse Primer 5′-AATGGGGAGAAATTCGGCTGTG-3′，由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。反應(yīng)體系：Real-time PCR Master Mix（2×）12．5μL，上下游引物（10μmol／L）各1μL，cDNA 1μL，Green DNA Ⅰdye（5×）3μL，用DEPC水將總反應(yīng)體積調(diào)至25μL。反應(yīng)條件為：95℃15min，然后95℃30s，60℃1min，72℃30s共40循環(huán)。同時(shí)用去離子水代替cDNA作為PCR反應(yīng)體系的陰性對(duì)照。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13．0軟件處理數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)，兩組間比較使用Turkey t檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 一般臨床資料的比較 12例NERD患者，7例男性，5例女性，平均年齡42．42歲；13例RE患者，8例男性，5例女性，平均年齡43．92歲；8例對(duì)照者為5例男性，3例女性，平均年齡43．5歲，各組間患者年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。12例RE患者內(nèi)鏡下食管下段黏膜均表現(xiàn)為充血、糜爛，少數(shù)患者可見潰瘍形成，有的潰瘍?nèi)诤铣砂咂瑺睢?例對(duì)照者和12例NERD患者的內(nèi)鏡下鱗、柱狀上皮交界（SCJ）和胃食管交界（EGJ）位于同一水平面，賁門開閉良好，齒狀線清晰、無上移，食管下段及賁門黏膜光滑、血管紋理清晰。

2．2 食道黏膜HE染色的比較 正常對(duì)照組除可見正常的食管復(fù)層鱗狀上皮和固有層，尚可見小動(dòng)、靜脈，有的可深達(dá)黏膜肌層，鏡下未見中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等炎性改變，符合正常食管下段的組織形態(tài)（圖1A）。NERD鏡下多數(shù)無異常表現(xiàn)，有時(shí)可見上皮基底細(xì)胞厚度增加，固有層乳頭延長(zhǎng)，伸向上皮層，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B）。RE中病變較輕者可見鱗狀上皮增生、不規(guī)則增厚，棘層亦增厚，基底層變厚，黏膜固有層乳頭上移，深入上皮超過65%，表層鱗狀細(xì)胞水腫、空泡變性（圖1C）。

圖1 各組食道黏膜HE染色結(jié)果Fig．1 HE staining of esophageal mucosa in each group

2．3 食管黏膜中nNOS和iNOS的分布比較 RE組nNOS蛋白主要在食管黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，密集分布，胞質(zhì)呈深黃至棕黃顆粒（圖2A），NERD組也主要在食管黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，但分布不如RE組密集，胞質(zhì)顏色呈淺黃色至黃色（圖2B）。正常對(duì)照組nNOS蛋白在食管黏膜上皮細(xì)胞中有少量表達(dá)（圖2C）。

圖2 RE、NERD和正常對(duì)照組的食道黏膜nNOS的分布Fig．2 Distribution of nNOS in the esophagus of RE and GERD patients and healthy subjects（×400）

RE組iNOS蛋白亦主要在食管黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)，密集分布，胞質(zhì)呈深黃至棕黃顆粒，少量iNOS細(xì)胞核也呈陽(yáng)性（圖3A）；NERD組也主要在食管黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，但分布不如RE組密集，胞質(zhì)顏色呈淺黃色至黃色（圖3B）。正常對(duì)照組iNOS蛋白在食管黏膜上皮細(xì)胞中幾乎未見表達(dá)（圖3C）。

2．4 食管黏膜中NOS含量的比較 nNOS和iNOS蛋白在食管黏膜中表達(dá)量均為RE組最大，NERD組次之，對(duì)照組最小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2．5 食管黏膜中NOS mRNA含量的比較 各組內(nèi)參基因Ct值基本接近，表明實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定。Ct值與mRNA的初始含量成反比。將各組Ct值帶入Real-time PCR專用軟件行隨機(jī)化檢驗(yàn)（randomization test），RE和NERD組的人食管下段黏膜nNOS mRNA和iNOS mRNA Ct值較對(duì)照組小，mRNA表達(dá)量豐富，與對(duì)照組相比差異有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而RE和NERD組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩種基因在RE組中的表達(dá)量最多（圖4）。

表1 NOS免疫組化染色灰度值的比較Tab．1 Comparison of immunohistological staining gray value of NOS（±s）

表1 NOS免疫組化染色灰度值的比較Tab．1 Comparison of immunohistological staining gray value of NOS（±s）

與對(duì)照組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，與NERD組比較，＃P＜0．01。

指 標(biāo) 對(duì)照組NERD RE nNOS 125．412 5±2．404 9 121．636 7±3．645 3＊ 118．735 4±2．753 8＊＊＃iNOS 137．831 3±4．240 9 129．703 3±3．534 3＊＊123．389 2±4．083 8＊＊＃

圖3 食道iNOS在RE、NERD和正常黏膜的分布Fig．3 Distribution of iNOS in the esophagus in RE and GERD patients and healthy subjects

圖4 RE、NERD和正常組食管粘膜nNOS（A）和iNOS（B）mRNA表達(dá)的比較Fig．4 Expressions of nNOS（A）and iNOS（B）mRNA in the esophagus of RE patients，GERD patients and healthy subjects

3 討 論

GERD是指胃十二指腸內(nèi)容物反復(fù)反流入食管的相關(guān)疾病，亞洲地區(qū)以每周至少發(fā)作1次燒心或反流為診斷標(biāo)準(zhǔn)，再按照內(nèi)鏡下食管表現(xiàn)，分為RE、NERD和Barrett食管炎3個(gè)類型［5-6］。近年患病率逐年上升［7］，在我國(guó)進(jìn)行的GERD流行病學(xué)調(diào)查，預(yù)測(cè)本病的年、月和周流行率分別為29．8%、8．9%和2．5%［8］，這雖然比西方發(fā)達(dá)國(guó)家低，但仍然造成了沉重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

GERD發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)變化主要為食管抗反流屏障功能減弱、食管黏膜屏障受損、反流的胃和（或）十二指腸內(nèi)容物侵襲食管黏膜，這也是各種類型GERD的共同發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。食管主要受興奮性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元雙重共同支配，食管上段為橫紋肌，主要受膽堿能神經(jīng)支配，食管下段的環(huán)形平滑肌則主要受非膽堿能神經(jīng)支配，其中食管下括約?。↙ES）的神經(jīng)支配中抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元起主要作用。目前，已經(jīng)證實(shí)了NO為腸神經(jīng)系統(tǒng)中非腎上腺素能以及非膽堿能神經(jīng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，該遞質(zhì)介導(dǎo)的食管反應(yīng)可能涉及到LES松弛、LES和食管環(huán)行肌的超極化及食管平滑肌的終止反應(yīng)，對(duì)維持其一定的張力起著重要作用，張力下降可能導(dǎo)致 TLESR 頻繁發(fā)生［4，9-10］。

NO由NOS介導(dǎo)生成，該酶是NO合成過程中唯一的限速酶，NO的生成量及生物學(xué)效應(yīng)直接受到其活性變化的調(diào)節(jié)，因此常采用測(cè)定NOS活性反映其組織細(xì)胞中NO的含量，并了解NO的合成部位以研究NO在不同部位的病理生理作用?，F(xiàn)已證實(shí)，食管括約肌張力受NO調(diào)節(jié)，NO增多使括約肌松弛，NO減少使括約肌收縮［4］，其機(jī)制目前認(rèn)為［11-13］，一方面NO可能是TLESR的啟動(dòng)因子，激活鳥苷酸環(huán)化酶，使環(huán)磷鳥苷增加，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2＋或?qū)a2＋的敏感性，引起肌肉松弛，從而使LES松弛，其中nNOS起到了主要作用［7］；另一方面使依賴cGMP的蛋白激酶活性上升，促使蛋白磷酸化使肌肉松弛，從而使LES松弛；另外，NO又是一種炎性介質(zhì)，一般認(rèn)為iNOS在正常狀態(tài)下不表達(dá)，需細(xì)胞因子等刺激后才會(huì)誘導(dǎo)性表達(dá)，而產(chǎn)生的NO則介導(dǎo)后繼效應(yīng)，并與超氧化物反應(yīng)產(chǎn)生過氧化亞硝酸（PXN），后者加速脂類和巰基化合物的氧化反應(yīng)，引起急慢性炎癥［14］。目前，普遍認(rèn)為導(dǎo)致食管黏膜損傷的重要因素是NOS的高表達(dá)，它產(chǎn)生的NO可能與食管疾病的發(fā)生和進(jìn)程有關(guān)。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了nNOS和iNOS在RE、NERD患者和正常食管黏膜組織中的表達(dá)，觀察發(fā)現(xiàn)RE患者食管黏膜組織中兩種NOS分布和表達(dá)均出現(xiàn)異常，食管黏膜上皮陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多，密集分布，著色加深，胞質(zhì)呈深黃至棕黃顆粒，NERD組也主要在食管黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)，但分布不如RE組密集，胞質(zhì)顏色呈淺黃色至黃色。正常對(duì)照組nNOS蛋白在食管黏膜上皮細(xì)胞中有少量表達(dá)，而iNOS表達(dá)缺如，分析各組間灰度并進(jìn)行兩兩比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），其中iNOS在RE中表達(dá)的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15］。同時(shí)，采用Real-time PCR方法檢測(cè)兩種NOS mRNA的相對(duì)含量，從基因水平進(jìn)一步論證其在GERD中的發(fā)展變化，發(fā)現(xiàn)3組之間也有顯著差異，mRNA表達(dá)量由正常食管黏膜到NERD再到RE逐漸遞增。GERD患者食管下段黏膜組織兩種NOS的分布和表達(dá)異常，共同引起食管組織內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間NO分布及量的改變，提示iNOS和nNOS可能共同引發(fā)食管平滑肌的收縮和舒張障礙，隨著病情逐漸加劇，這種改變有進(jìn)行性加重的趨勢(shì)。該異常表達(dá)可能與LES的功能失調(diào)有關(guān)，從而出現(xiàn)反酸、噯氣、胸骨后疼痛等臨床癥狀，反流又可刺激食管組織產(chǎn)生NO，這也進(jìn)一步說明在GERD發(fā)生發(fā)展中，NO可能是導(dǎo)致?lián)p傷的主要機(jī)制之一。

綜上所述，本研究探索了GERD患者食管下段黏膜組織中nNOS、iNOS的蛋白和mRNA的表達(dá)變化，為臨床開拓新的治療方法提供了理論上的依據(jù)。但由于時(shí)間、經(jīng)費(fèi)等各方面的限制，本研究?jī)H在小樣本范圍內(nèi)進(jìn)行了探討，以后還需要在大樣本研究中進(jìn)一步證實(shí)。

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