Twist和VEGF在上皮性卵巢癌中的表達(dá)

楊麗娜，吳 娟，趙 靜，戴 斌，楊 紅

（1．第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710032；2．中國兵器工業(yè)衛(wèi)生研究所，陜西西安 710065；3．第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽胰脾外科，陜西西安 710032）

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第二位，但致死率卻為各類婦科腫瘤之首［1］，對婦女的生命健康造成嚴(yán)重威脅。美國癌癥學(xué)會最新報道稱，2013年大約有22 240新發(fā)病例被診斷為卵巢癌，同年14 030名患者死于該疾?。?］。它具有起病隱匿、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點。隨著現(xiàn)代檢測及治療手段的進(jìn)步，卵巢癌治療取得了長足進(jìn)展，但由于其較高的轉(zhuǎn)移率及復(fù)發(fā)率，總體預(yù)后依舊較差。因此，探討卵巢癌的發(fā)病機(jī)制以及探尋影響其浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，將有利于提高卵巢癌患者的總體治療有效率及生存率。Twist蛋白既是一種癌基因蛋白，又是調(diào)控上皮間質(zhì)化（epithelial-mesenchy-mal transition，EMT）的重要轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞凋亡及惡性腫瘤的形成、侵襲、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［3］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是腫瘤血管形成的關(guān)鍵調(diào)控因子，是目前所知作用最強(qiáng)的血管生成刺激因子，通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和移行，增加腫瘤血管的通透性，增強(qiáng)癌細(xì)胞浸潤能力，最終促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移，已成為腫瘤治療新靶點。目前，兩者在卵巢癌中的關(guān)系尚無報道。本研究通過免疫組織化學(xué)法，檢測Twist和VEGF在卵巢癌中的表達(dá)，分析兩者與臨床病理特征的關(guān)系，并探討它們在卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)性。

1 資料與方法

1．1 標(biāo)本來源 本實驗所有標(biāo)本選自2010年9月至2013年1月第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院及陜西省中醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實為上皮性卵巢癌及正常卵巢組織所制蠟塊，其中上皮性卵巢癌組織標(biāo)本80例，均為原發(fā)性腫瘤，術(shù)前未接受放化療、未服用激素類藥物。年齡：＜50歲43例，≥50歲37例；FIGO分期：Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期37例；病理分級：Gl級28例，G2級35例，G3級17例；組織分化類型：漿液性囊腺癌51例，黏液性囊腺癌29例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移20例，無轉(zhuǎn)移60例。對照組10例正常卵巢組織來自卵巢活檢病例和因子宮肌瘤、功能性子宮出血或子宮脫垂行全子宮切除同時行卵巢切除病例，病理證實卵巢組織無異常。

1．2 主要試劑 Twist兔抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司，工作濃度按照1∶100的體積濃度進(jìn)行稀釋。VEGF鼠抗人單克隆抗體（一抗稀釋濃度為1∶50）、SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1．3 方法 采用免疫組化SP法，所有標(biāo)本經(jīng)40g／L多聚甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，石蠟切片常規(guī)脫蠟，PBS沖洗，高溫高壓抗原修復(fù)，加Twist及VEGF工作液4℃過夜，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。PBS代替一抗作為陰性對照。

1．3．1 結(jié)果判斷 按照半定量積分法判定結(jié)果：光鏡下，以胞質(zhì)出現(xiàn)棕色或棕褐色顆粒作為陽性結(jié)果，由2名病理醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立雙盲評分。每張切片隨機(jī)選取5個400倍光學(xué)顯微鏡下視野，將所選取視野中陽性細(xì)胞的染色范圍及染色強(qiáng)度依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行半定量化，最終結(jié)果取平均值。具體標(biāo)準(zhǔn)為：①染色范圍計分，將陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比率按照＜5%，6%～25%，26%～50%，51%～75%，＞75%分別記為0、1、2、3、4分；②染色強(qiáng)度分，按照未染色、淡黃色、棕色、棕褐色分別記為0、1、2、3分。染色范圍計分與染色強(qiáng)度計分乘積為染色結(jié)果：0～2分為陰性表達(dá)（-），≥3分為陽性表達(dá)，其中3～6分為低表達(dá)（＋），7～12分為高表達(dá)（■）。

1．3．2 統(tǒng)計學(xué)分析 計數(shù)資料以百分率表示，Twist、VEGF蛋白陽性表達(dá)率比較采用χ2檢驗，所有檢驗為雙側(cè)檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，應(yīng)用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析、求Spearman秩相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié) 果

2．1 Twist在卵巢癌及正常卵巢組織中的的表達(dá)情況 Twist蛋白陽性染色主要定位于卵巢癌及正常卵巢細(xì)胞的胞質(zhì)中，在上皮性卵巢癌組織中，60%（48／80）高表達(dá)，25%（20／80）低表達(dá)，15%（12／80）陰性表達(dá)；在正常卵巢組織中，免疫組化染色顯示僅10%（1／10）低表達(dá)，其余均為陰性（圖1）。

圖1 Twist在正常卵巢組織（A）和上皮性卵巢癌組織（B、C、D）中的表達(dá)情況Fig．1 Expression of Twist in normal ovarian tissues and epithelial ovarian cancer tissues（×200）

2．2 VEGF在卵巢癌及正常卵巢組織中的的表達(dá)情況 VEGF蛋白陽性染色主要定位于卵巢癌及正常卵巢細(xì)胞的胞質(zhì)中，在上皮性卵巢癌組織中，62．5%（50／80）高表達(dá)，23．7%（19／80）低表達(dá)，13．8%（11／80）陰性表達(dá)；在正常卵巢組織中，免疫組化染色顯示低表達(dá)20%（2／10），其余80%（8／10）為陰性表達(dá)（圖2）。

圖2 VEGF在正常卵巢組織（A）和上皮性卵巢癌組織（B、C、D）中的表達(dá)情況Fig．2 Expression of VEGF in normal ovarian tissues and epithelial ovarian cancer tissues（×200）

2．3 Twist與VEGF在上皮性卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá)情況 Twist與VEGF在卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常卵巢組織。其中，Twist蛋白在在上皮性卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率85%（68／80），在正常卵巢組織中的陽性表達(dá)率10%（1／10），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；VEGF蛋白在上皮性卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率86．25%（69／80），在正常卵巢組織中的陽性表達(dá)率20%（2／10），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01，表1）。

2．4 Twist與VEGF表達(dá)和卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系 Twist與VEGF表達(dá)水平與卵巢癌的臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0．01），與卵巢癌患者年齡、組織類型無關(guān)（P＞0．05，表2）。

表1 Twist與VEGF在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá)情況Tab．1 The expressions of Twist and VEGF in epithelial ovarian cancer and normal ovarian tissues ［n（%）］

表2 Twist與VEGF蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系Tab．2 Correlation of Twist and VEGF expressions with clinical pathological data of epithelial ovarian cancer

2．5 卵巢癌組織中Twist和VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析 Spearman秩相關(guān)分析顯示，在上皮性卵巢癌組織中Twist表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0．646，P＜0．01，表3）。

3 討 論

侵襲和轉(zhuǎn)移是卵巢癌最重要的生物特征之一，也是卵巢癌治療失敗和死亡的直接因素。因此，如何更好地抑制癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移成為卵巢癌臨床治療和基礎(chǔ)研究的熱點和難點。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，即上皮細(xì)胞從有極性的上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨冗\(yùn)動性的纖維母細(xì)胞樣或間葉性表型，在早期胚胎發(fā)生中發(fā)揮重要作用。體外及體內(nèi)研究均表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制在上皮性腫瘤的進(jìn)展、浸潤、侵襲轉(zhuǎn)移中得以激活，是上皮來源的腫瘤細(xì)胞獲得侵襲性的關(guān)鍵分子事件，在惡性腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移播散過程中發(fā)揮主要的病理作用［4］。Twist基因最初在果蠅的胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞移動和組織重建，誘導(dǎo)中胚層發(fā)育。目前研究證實，Twist在多種人類上皮來源腫瘤中高表達(dá)［5-7］，與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象及腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的關(guān)鍵調(diào)控因子［3］。研究表明，在乳腺癌組織中Twist通過誘導(dǎo)CCL2招募巨噬細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，形成腫瘤微血管［8］。在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)Twist可促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，Twist在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT及生成內(nèi)皮依賴性血管過程中發(fā)揮著重要的作用［9］。KAJIYAMA等［10］研究發(fā)現(xiàn)，Twist與卵巢癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果表明，Twist蛋白在卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于正常卵巢組織，同時Twist表達(dá)水平與卵巢癌的分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0．05），與其他文獻(xiàn)報道的研究結(jié)果一致。提示Twist在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移中起作用。

表3 Twist與VEGF在卵巢癌中表達(dá)的相關(guān)性分析Tab．3 The correlation between Twist and VEGF expressions in epithelial ovarian cancer

VEGF是一種高度特異性的促血管生成因子，通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體（VEGFR）結(jié)合后可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，增加腫瘤血管的通透性，促進(jìn)實體腫瘤的進(jìn)展［11］。而腫瘤血管生成在腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移中起重要作用，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要表現(xiàn)，血管生成作為腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中的一個重要因素參與并影響腫瘤的生物學(xué)行為［12］。本研究中卵巢癌組織中VEGF蛋白的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織，且其表達(dá)與FIGO分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0．05），提示VEGF是腫瘤細(xì)胞生長發(fā)展的重要促進(jìn)因子，可能參與上皮性卵巢癌的發(fā)生及惡性侵襲、轉(zhuǎn)移，抑制VEGF的生成，可能減緩腫瘤的侵襲。

Twist可以調(diào)節(jié)VEGF mRNA及蛋白表達(dá)在肝癌、非小細(xì)胞肺癌組織中已有相關(guān)報道［13］。有研究表明，VEGF與VEGFR結(jié)合后，胰腺癌細(xì)胞系Twist表達(dá)增加，進(jìn)而出現(xiàn)EMT表型改變，侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［14］。MIRONCHIK等［13］通過體內(nèi)外實驗證實上調(diào)乳腺癌細(xì)胞Twist表達(dá)后，VEGF表達(dá)亦隨之增加。本研究首次在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)Twist和VEGF表達(dá)呈明顯正相關(guān)（r＝0．646，P＜0．01），提示Twist和VEGF在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中起協(xié)同作用。其機(jī)制可能是：一方面Twist增加VEGF表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管、淋巴管生成，增加其通透性，利于腫瘤組織營養(yǎng)供應(yīng)，加速腫瘤的演進(jìn)過程，促進(jìn)轉(zhuǎn)移，并且脫落的癌細(xì)胞易播散于盆腹腔，進(jìn)一步誘導(dǎo)播散部位腫瘤血管生成，從而增加其侵襲、轉(zhuǎn)移能力；另一方面，VEGF通過上調(diào)Twist表達(dá)，誘導(dǎo)EMT，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞穿過細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)入淋巴管、血管及腫瘤組織表面能，利于播散、轉(zhuǎn)移。但兩者的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確。

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