G蛋白偶聯(lián)的內(nèi)整流型鉀通道在哮喘模型大鼠肺組織的表達(dá)

楊旭東，寧啟蘭，蔣曉剛，孫青竹，劉 莉，韓 燕，張富軍，王慧蓮

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部遺傳學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061）

過(guò)敏性哮喘是一種常見的Th2細(xì)胞介導(dǎo)的支氣管過(guò)敏性炎癥性疾?。?］。目前尚無(wú)治療哮喘的有效方法，但近年來(lái)過(guò)敏性哮喘在我國(guó)的發(fā)病率卻呈不斷上升的趨勢(shì)，深入研究哮喘的發(fā)病機(jī)制對(duì)于建立更有效的治療方法具有重要意義［2］。大量研究顯示，多種外向型鉀通道在哮喘氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性以及氣道重塑等病理生理過(guò)程中均發(fā)揮重要的作用，被視為治療哮喘的藥物靶點(diǎn)［3］。而G蛋白偶聯(lián)的內(nèi)整流鉀通道（G protein-coupled inwardly rectifying potassium channel，GIRK）可在被活化的G蛋白釋放的Gβγ復(fù)合物激活后產(chǎn)生內(nèi)向電流，對(duì)于膜電位的恢復(fù)具有重要意義［4］。研究發(fā)現(xiàn)，GIRK通道在正常的氣道上皮細(xì)胞表面表達(dá)［5］。G蛋白偶聯(lián)受體廣泛參與了哮喘的病程［6］，并且組胺、乙酰膽堿等多種可引發(fā)氣道異常收縮的神經(jīng)遞質(zhì)也都可激活GIRK［7-8］。因此，我們推測(cè)GIRK通道與哮喘也有密切的聯(lián)系。為了驗(yàn)證假說(shuō)，我們檢測(cè)了E3大鼠哮喘模型肺組織中構(gòu)成GIRK的各種亞基表達(dá)水平的變化，及受到IL-4刺激的氣道上皮細(xì)胞中GIRK通道表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 成年健康E3大鼠，雌雄各半，共16只，體質(zhì)量160～200g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部遺傳學(xué)與分子生物學(xué)系提供。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和硫酸鋁鉀（aluminium potassium sulfated）由Sigma公司提供；小鼠抗大鼠IgE重鏈抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗大鼠λ鏈κ鏈抗體由 AbD Serotec公司提供；抗 GIRK1和GIRK3的抗體由Bioworld公司提供；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗兔抗體和IL-4由博奧森公司提供。

1．2 哮喘模型的制備 把16只E3大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組與哮喘模型組，每組8只。哮喘模型組大鼠腹腔注射1mg／mL OVA、50mg／mL鋁佐劑，注射后第14天，令大鼠吸入100μL 1mg／mL OVA的溶液，激發(fā)哮喘。每天1次，連續(xù)7d。對(duì)照組大鼠腹腔注射磷酸鹽緩沖液（PBS），注射后14d，令大鼠吸入PBS。末次激發(fā)24h后處死動(dòng)物。

1．3 組織化學(xué)染色觀察肺組織的病理學(xué)改變 取大鼠左側(cè)第三葉肺，經(jīng)4g／L多聚甲醛固定、脫水，用石蠟包埋組織并切片。用蘇木素-伊紅染色（HE），在顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞在肺組織的浸潤(rùn)。高碘酸-雪夫反應(yīng)（PAS）染色，觀察支氣管黏液的生成。

1．4 ELISA檢測(cè)血清總IgE水平 用2μg／mL小鼠抗大鼠IgE重鏈抗體包被酶標(biāo)板。在每孔中加入150μL封閉液，在37℃封閉1h。在每一孔中加入50μL 1 000倍稀釋的血清樣品，37℃孵育1h。在每一孔中加入50μL 3 000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗大鼠λ／κ鏈抗體，37℃孵育30min。在每一孔中加入100μL的TMB底物，37℃孵育20min。隨后每孔加入100μL 1．87mol／L的 H2SO4以終止反應(yīng)，在450nm波長(zhǎng)讀取A值。

1．5 RT-PCR檢測(cè)肺組織和A549細(xì)胞中GIRK各亞基的mRNA水平 用Trizol提取肺組織和A549細(xì)胞中的總RNA，在核酸蛋白定量?jī)x上測(cè)定RNA樣品的濃度。取2μg總RNA，用MBI的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR所需的引物序列見表1。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10μL，引物濃度為10pmol／μL。擴(kuò)增條件：94℃ 變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行定量。

表1 人與大鼠GIRK各亞基以及管家基因的引物序列Tab．1 The primers for GIRK subunits and house-keeping genes of rats and humans

1．6 Western blot檢測(cè)肺組織和A549細(xì)胞中GIRK1和GIRK3的蛋白水平 用RIPA裂解組織與細(xì)胞提取蛋白質(zhì)。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白樣品的濃度。在100 mL／L分離膠后電泳分離不同的蛋白，電壓為120V；把蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，電壓100V；轉(zhuǎn)膜后，用50g／L的脫脂奶粉封閉；用1 000倍稀釋的抗GIRK1或是GIRK3抗體作為一抗，用5 000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗兔IgG作為二抗，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液發(fā)光，用X光片顯影。

1．7 免疫組化染色觀察肺組織GIRK1的表達(dá)水平肺組織的石蠟切片經(jīng)脫蠟至水，用0．979mol／L H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。用胰酶修復(fù)抗原，用牛血清白蛋白封閉30min，滴加兔抗GIRK1抗體（1∶100）4℃過(guò)夜，再滴加生物素標(biāo)記的抗兔抗體在37℃孵育30min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素在37℃孵育20min，用DAB顯色。

1．8 IL-4刺激對(duì)A549細(xì)胞GIRK表達(dá)的影響A549細(xì)胞用含有100mL／L的小牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。按照5×105／孔把細(xì)胞種到6孔板，分別用0、25、50、100ng／mL IL-4刺激24h；另外用50 ng／mL IL-4分別刺激 A549細(xì)胞0、6、12、24、48h，觀察IL-4刺激劑量、時(shí)間與GIRK表達(dá)水平的關(guān)系。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)照組與哮喘模型組之間總IgE的比較采用Student t檢驗(yàn)。采用重復(fù)測(cè)量單因素方差分析來(lái)比較IL-4刺激的細(xì)胞中GIRK1-4表達(dá)情況。所有統(tǒng)計(jì)采用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism5完成，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 E3大鼠哮喘模型的評(píng)估 組織切片HE染色，在光鏡下可見對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，氣道周圍無(wú)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A）；哮喘模型組肺組織的支氣管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B）。另外，組織切片的PAS染色也顯示在對(duì)照組的氣道上皮生成的黏液較少（圖1C），而哮喘模型組的氣道上皮中黏液的生成也顯著增強(qiáng)（圖1D）。哮喘模型組與對(duì)照組相比，血清總IgE水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．024，圖2）。肺組織的病理切片以及血清中IgE水平的檢測(cè)都顯示OVA在E3大鼠引發(fā)炎癥，哮喘模型誘導(dǎo)成功。

圖1 E3大鼠哮喘模型的肺組織的病理改變Fig．1 The pathological changes of the lung in E3rat asthma model

圖2 哮喘模型組和對(duì)照組血清總IgE水平的比較Fig．2 The levels of total IgE in asthma model and control groups

2．2 GIRK各亞基表達(dá)的改變 在正常大鼠以及哮喘模型大鼠的肺組織中，構(gòu)成GIRK通道的4種亞基，GIRK1、2、3以及4均有表達(dá)。與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織GIRK1、2、3、4的mRNA水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．008、0．005、0．001 6、0．002，圖3）。Western blot結(jié)果顯示，哮喘組大鼠肺組織中GIRK1和GIRK3的蛋白水平低于對(duì)照組（圖4）。用抗GIRK1亞基的抗體做免疫組化，GIRK1亞基的陽(yáng)性染色主要分布于氣道上皮（圖5）。GIRK1在正常對(duì)照組染色較少，哮喘模型組大鼠氣道上皮的陽(yáng)性染色增多（圖5）。

圖3 哮喘模型組和對(duì)照組肺組織GIRK各亞基mRNA水平的比較Fig．3 The mRNA levels of GIRK subunits in the lung in asthma model and control groups

圖4 哮喘模型組和對(duì)照組肺組織GIRK1、GIRK3蛋白水平的比較Fig．4 The protein levels of GIRK1and GIRK3in the lung in asthma model and control groups

圖5 哮喘模型組和對(duì)照組肺組織GIRK1的表達(dá)Fig．5 The expression of GIRK1in the lung in asthma model and control groups（×400）

2．3 IL-4對(duì)A549細(xì)胞GIRK通道表達(dá)的影響 IL-4可下調(diào)GIRK各亞基的表達(dá)。在作用24h后，與對(duì)照組相比，25、50、100ng／mL的IL-4下調(diào)GIRK1、GIRK3和GIRK4mRNA的表達(dá)水平，重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，各濃度間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝70．86，P＜0．000 1；F＝67．13，P＜0．000 1；F＝52．23，P＜0．000 1）（表2）。另外，在50ng／mL IL-4處理6、12、24、48h，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，GIRK1、GIRK3和 GIRK4 mRNA水平也下降，重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，各時(shí)間點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝73．14，P＜0．000 1；F＝36．62，P＝0．0003；F＝13．44，P＝0．0045）（表3）。而較高濃度IL-4（≥50ng／mL）處理24h以上可下調(diào)GIRK2的表達(dá)水平，但是GIRK2的mRNA水平與IL-4濃度之間無(wú)時(shí)間與劑量依賴關(guān)系。

2．4 IL-4下調(diào)A549細(xì)胞GIRK的蛋白水平 Western blot結(jié)果顯示，不同劑量的IL-4刺激A549細(xì)胞24h后，GIRK1和GIRK3的蛋白表達(dá)水平也表現(xiàn)出劑量依賴性的下降（圖6）。

3 討 論

長(zhǎng)期以來(lái)，鉀通道在哮喘中的作用一直廣受關(guān)注，但這種關(guān)注主要集中在鉀通道開放對(duì)氣道平滑肌興奮性的影響上；而對(duì)鉀通道在肺組織非興奮性細(xì)胞中的作用及變化都較少涉及。近年來(lái)，研究人員陸續(xù)在氣道上皮細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)了30多種鉀通道，它們分別歸屬于具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的電壓依賴性鉀通道、具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的Ca2＋依賴性鉀通道、具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的雙孔鉀通道和具有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的內(nèi)整流鉀通道［9］。而且氣道上皮細(xì)胞表面的鉀通道與細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)也有密切的聯(lián)系，目前已知多種鉀通道可作為氣道上皮細(xì)胞的氧分壓的感受器，并可調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞的遷移、增殖及氯離子和鈉離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)［9］。由于氣道上皮對(duì)于先天性免疫、繼發(fā)免疫、氣道收縮和重塑等過(guò)程有廣泛的調(diào)節(jié)作用［10］，氣道上皮細(xì)胞表面鉀通道在哮喘病程中的作用也成為哮喘研究的重點(diǎn)之一。

表2 IL-4刺激24h后GIRK各亞基mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Tab．2 The mRNA levels of GIRK subunits after 24-hour stimulation with IL-4（±s，n＝3）

表2 IL-4刺激24h后GIRK各亞基mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Tab．2 The mRNA levels of GIRK subunits after 24-hour stimulation with IL-4（±s，n＝3）

亞基 0（ng／mL）IL-4 25（ng／mL）IL-4 50（ng／mL）IL-4 100（ng／mL）IL-4 GIRK1 0．147 6±0．011 84 0．121 6±0．013 6 0．047 7±0．008 5 0．043 1±0．012 5 GIRK2 0．130 4±0．023 90 0．144 9±0．009 6 0．062 3±0．010 2 0．060 1±0．013 7 GIRK3 0．127 4±0．012 75 0．075 8±0．009 7 0．040 4±0．007 8 0．045 3±0．005 9 GIRK4 0．071 4±0．015 50 0．066 9±0．009 3 0．023 1±0．008 7 0．042 3±0．009 1

表3 IL-4刺激不同時(shí)間點(diǎn)GIRK各亞基mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Tab．3 The mRNA levels of GIRK subunits after IL-4stimulation at different time points（±s，n＝3）

表3 IL-4刺激不同時(shí)間點(diǎn)GIRK各亞基mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Tab．3 The mRNA levels of GIRK subunits after IL-4stimulation at different time points（±s，n＝3）

亞基0h 6h 12h 24h 48h GIRK1 0．174 00±0．070 24 0．130 0±0．025 1 0．103 7±0．010 02 0．055 7±0．010 9 0．050 7±0．012 7 GIRK2 0．058 77±0．009 40 0．052 8±0．009 5 0．056 0±0．022 90 0．037 5±0．007 5 0．035 9±0．004 8 GIRK3 0．107 70±0．014 50 0．052 6±0．016 0 0．046 3±0．006 40 0．035 3±0．009 1 0．035 6±0．006 8 GIRK4 0．104 70±0．018 10 0．088 3±0．009 4 0．042 2±0．008 60 0．034 3±0．007 5 0．034 3±0．005 6

圖6 IL-4刺激24hA549細(xì)胞中GIRK1和GIRK3的蛋白水平的改變Fig．6 The protein levels of GIRK1and GIRK3in A549cell line after 24-hour stimulation with IL-4

GIRK是內(nèi)整流鉀通道的家族成員，由四種亞基構(gòu)成的同四聚體或異四聚體，它可形成內(nèi)向的鉀電流［4］。由于GIRK可形成內(nèi)向型鉀電流，所以它與外向型鉀通道的作用相反，可導(dǎo)致胞膜去極化［4］。目前對(duì)于GIRK通道功能的研究主要集中在神經(jīng)和心肌等可興奮組織；關(guān)于GIRK通道在肺組織及呼吸系統(tǒng)疾病中作用研究的很少。我們所觀察到的GIRK通道在哮喘模型中表達(dá)下降是首次報(bào)道GIRK通道與過(guò)敏性哮喘有關(guān)聯(lián)。

雖然GIRK通道在哮喘病程中的作用還不明確，但由于G蛋白偶聯(lián)受體與氣道炎癥、氣道收縮、氣道重塑等哮喘病程的各個(gè)環(huán)節(jié)都密切相關(guān)［5］；特別是G蛋白偶聯(lián)受體在氣道上皮功能的調(diào)節(jié)中有重要的作用［5］；而GIRK通道是G蛋白偶聯(lián)受體下游的效應(yīng)分子，因此它也成為哮喘調(diào)節(jié)環(huán)路上的一個(gè)環(huán)節(jié)。GIRK可被Gi蛋白激活［12］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種存在于氣道上皮細(xì)胞表面的Gi蛋白偶聯(lián)受體，它們與配體結(jié)合后往往可舒張支氣管平滑肌、降低趨化因子的釋放、抑制炎癥發(fā)生，從而減輕哮喘的癥狀。例如，苦味素受體Tas2R［11］和溶血磷脂酸受體P2Y5等［12］受體都與 Gi蛋白偶聯(lián)［13-14］，它們與配體結(jié)合后可減輕氣道炎癥。GIRK通道就是這些Gi蛋白偶聯(lián)受體的下游分子。因此，GIRK通道表達(dá)水平的下降可能與哮喘病程中Gi蛋白偶聯(lián)受體抑炎作用的削弱有關(guān)。

IL-4是哮喘病程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的促炎因子，它可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道炎癥以及黏液高分泌［15-16］。此外，IL-4還可調(diào)節(jié)鉀通道的功能，IL-4可增強(qiáng)大電導(dǎo)率 Ca2＋激活的鉀通道［BK（Ca）］電流［17］。BK（Ca）是外向型鉀通道，增強(qiáng)BK（Ca）電流可促進(jìn)胞膜極化。我們的結(jié)果顯示，IL-4可下調(diào)GIRK通道的表達(dá)。GIRK的作用與BK（Ca）相反，會(huì)促進(jìn)胞膜去極化。由此可見，IL-4可以協(xié)調(diào)不同類型的鉀通道的活動(dòng)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。

IL-4對(duì)氣道上皮細(xì)胞GIRK通道的表達(dá)的調(diào)節(jié)反映了哮喘病程中各種免疫因素與非免疫性的因素之間錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用，也為我們認(rèn)識(shí)疾病提供了新的視角。進(jìn)一步闡明GIRK通道在哮喘及氣道上皮中的作用必然會(huì)促進(jìn)我們深入了解哮喘的發(fā)病機(jī)制，并為尋找更有效的治療策略提供線索。

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