腫瘤相關(guān)基因S100A6在肺腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

郎紅娟　姜　華　金發(fā)光

楊拴盈2　南巖東1

腫瘤相關(guān)基因S100A6在肺腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

郎紅娟1姜華1金發(fā)光1

楊拴盈2南巖東1

第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院后備人才基金(5033)

作者單位： 710038 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科1

710004 西安，西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科2

EF手型鈣結(jié)合蛋白S100A6是S100蛋白家族的重要成員之一，在鈣離子存在的條件下，通過與靶蛋白的相互作用而發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[1]。近年來的研究顯示，S100A6基因廣泛參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、周期、凋亡、分化等一系列生物學(xué)過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切[2-3]。然而，目前尚不清楚肺腺癌S100A6基因表達(dá)與其臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。為此，我們應(yīng)用RT-PCR和Western-blot 等方法，對肺腺癌組織及A549肺腺癌細(xì)胞系S100A6基因表達(dá)進(jìn)行檢測，旨在為進(jìn)一步探索S100A6基因在肺腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為作用機(jī)制的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

對象與方法

一、研究對象

收集2010年1月至2012年1月第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院手術(shù)后肺腺癌患者標(biāo)本20例，其中男10例，女10例；年齡26～73歲；具有吸煙史13例，無吸煙史7例；臨床分期I期4例，Ⅱ期5例，Ⅲ期4例，Ⅳ期7例。A549人肺腺癌癌細(xì)胞購至上海中科院細(xì)胞庫。

二、試驗(yàn)方法

1. 試劑：S100A6抗體購自美國Sigma公司，GAPDH抗體購于安博生物技術(shù)公司；PCR相關(guān)試劑購于寶生物工程(大連)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購于Hyclone公司，胰蛋白酶、胎牛血清(Sigma公司)，其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

2. 組織標(biāo)本處理：手術(shù)切除離體0.5 h肺腺癌標(biāo)本，分別剪取大小約2 cm×2 cm×2 cm的肺癌組織及距離癌組織5 cm以上正常肺組織，生理鹽水反復(fù)沖洗去除血液，放入焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate, DEPC)水處理的凍存管，儲存液氮罐中。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)：A549細(xì)胞采用RPMI1640培養(yǎng)基(含有10%新生小牛血清，100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素)，在含5%CO2、37 ℃飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 肺腺癌組織S100A6 mRNA和蛋白表達(dá)檢測: 應(yīng)用RT-PCR檢測肺腺癌組織 mRNA表達(dá)，組織勻漿后，按照Trizol說明書提取RNA，測定總RNA的純度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以適量cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化PCR擴(kuò)增。S100A6上游引物：5′-ATGGCATGCCCCCTGGAT-3′，下游引物為：5′-TGAGGGCTTCATTGTAGATC-3′；β-actin 上游引物為：5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3，下游引物為：5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3。擴(kuò)增條件為：94 ℃/3 min；94 ℃/30 s，57 ℃/30 s，72 ℃/40 s；循環(huán)32圈。72 ℃延伸10 min。圖像采集后，通過比較S100A6和β-actin mRNA條帶灰度值評價(jià)A549細(xì)胞中S100A6 mRNA的相對表達(dá)量。

應(yīng)用Western-blot檢測S100A6 蛋白表達(dá)。組織標(biāo)本勻漿，加入適量細(xì)胞裂解液，6 000×g，離心15 min，取上清，采用BCA進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后置-80 ℃貯存?zhèn)溆?。灌?2%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗(1︰200)，4 ℃孵育過夜，二抗(1︰2 000)，室溫孵育2 h，ECL(化學(xué)熒光發(fā)光法)顯色。圖像經(jīng)Uvpgrabit Image軟件測定各條帶的吸光度，以各條帶的吸光度值與GAPDH吸光度值的比值進(jìn)行蛋白表達(dá)量的比較。

5. 肺腺癌細(xì)胞S100A6 mRNA和蛋白表達(dá)檢測: 收集處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞進(jìn)行S100A6 mRNA和蛋白表達(dá)檢測，具體方法同上。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié)果

一、肺腺癌組織與癌旁正常組織S100A6 mRNA和蛋白差異表達(dá)

Western-blot分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織S100A6吸光度值與GAPDH吸光度值比值為0.76±0.19，癌旁正常肺組織吸光度值比值為0.29±0.15，二者比較差異具有顯著性(P<0.05)，見表1。圖1、2；RT-PCR分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織S100A6和β-actin mRNA條帶灰度比值為0.77±0.39，癌旁正常肺組織條帶灰度比值為0.15±0.08，二者比較差異具有顯著性(P<0.05)。

表1　S100A6在肺腺癌組織和癌旁正常組織差異表達(dá)

注：Western Blot：免疫印跡試驗(yàn)；RT- PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR

圖1Western-blot檢測S100A6蛋白在肺腺癌組織表達(dá)，T:肺腺癌組織, N:癌旁正常肺組織

圖2RT-PCR檢測S100A6基因在肺腺癌組織表達(dá)，T:肺腺癌組織, N:癌旁正常肺組織

二、肺腺癌組織S100A6 mRNA和蛋白表達(dá)與臨床特征關(guān)系分析

肺腺癌組織S100A6與患者臨床特征關(guān)系分析顯示，在大于或等于60歲和小于60歲的兩個(gè)年齡組患者中S100A6 mRNA和蛋白表達(dá)均無顯著性差異(P>0.05)，在男、女兩組之間無顯著性差異(P>0.05)；而吸煙指數(shù)(吸煙指數(shù)=每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù))大于或等于200組S100A6 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于吸煙指數(shù)小于200組(P<0.05)；ⅢⅣ分期組S100A6 mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于Ⅲ分期組(P<0.05)，見表2。

表2　S100A6表達(dá)與患者臨床病理特征關(guān)系

注：Western Blot：免疫印跡試驗(yàn)；RT- PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR

三、A549肺腺癌細(xì)胞系S100A6 mRNA和蛋白表達(dá)

進(jìn)一步檢測 A549人肺腺癌細(xì)胞系S100A6 mRNA相對表達(dá)量為0.43±0.12，蛋白表達(dá)量為0.38±0.14，見圖3。

圖3S100A6基因在肺腺癌A549細(xì)胞系的表達(dá)，A:Western-blot，B:RT-PCR

討論

原發(fā)性支氣管肺癌(簡稱肺癌)是目前最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)病理學(xué)和生物學(xué)行為的不同，肺癌分為鱗癌、腺癌、小細(xì)胞肺癌和大細(xì)胞未分化癌。肺腺癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，已經(jīng)成為最常見的肺癌組織學(xué)類型之一[6]。近年來，盡管多學(xué)科聯(lián)合治療在一定程度上延長了肺腺癌的生存時(shí)間，但由于肺腺癌惡性程度高，早期即可出現(xiàn)胸膜、縱隔淋巴結(jié)、骨骼、腦等器官的轉(zhuǎn)移，致使患者初診時(shí)已處于Ⅲ-Ⅳ期，失去了手術(shù)治療的時(shí)機(jī)，5年生存率仍然不足5%[7]。因此，探索肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制并尋找特異性的分子靶點(diǎn)，對肺腺癌的診治具有重大意義。

前期應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織與癌旁組織S100A6肽段峰具有顯著性差異，提示其有可能作為肺腺癌重要的生物標(biāo)志物[8]。S100A6鈣結(jié)合蛋白是1987年Kuznicki和Filipek在研究腹水瘤過程中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)鈣結(jié)合蛋白，相對分子量約10.5×103，當(dāng)時(shí)命名為“鈣周期蛋白(Calcyclin)”，而后經(jīng)研究證實(shí)Calcyclin屬于S100蛋白家族[9]?，F(xiàn)在已經(jīng)明確的S100家族成員有21個(gè)，S100A6蛋白是S100蛋白家族成員之一，在細(xì)胞中呈離散性分布，主要存在于胞質(zhì)、胞膜以及核被膜[10]。應(yīng)用多克隆抗體技術(shù)發(fā)現(xiàn)S100A6蛋白存在于骨骼肌、心臟、胃、肺、腎等多種組織器官中[11-13]。S100A6蛋白功能包括鈣傳感器、釋放細(xì)胞內(nèi)鈣信號、調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞分化，刺激Ca2+依賴的胰島素釋放、刺激催乳素分泌及胞外分泌等[14]。

本研究中，我們首先應(yīng)用RT-PCR和Western-blot等研究方法，發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織S100A6基因和蛋白表達(dá)顯著高于癌旁正常肺組織(P<0.05)。進(jìn)一步對S100A6表達(dá)與其臨床病理特征分析，發(fā)現(xiàn)吸煙程度和腫瘤分期是影響其表達(dá)的重要因素，且吸煙程度越重、腫瘤分期越晚，S100A6基因和蛋白表達(dá)越明顯，提示S100A6可能在致癌因素的作用下早期即參與了肺癌惡變過程，并且伴隨了肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列生物學(xué)過程。腫瘤細(xì)胞系是研究腫瘤生物學(xué)特性的重要的動(dòng)物模型，但是S100A6在肺腺癌細(xì)胞系的表達(dá)情況尚不清楚，我們應(yīng)用RT-PCR和Western-blot證實(shí)了S100A6基因和蛋白在A549肺腺癌細(xì)胞系能夠穩(wěn)定高表達(dá)，為進(jìn)一步采用RNA干擾、基因敲除等方法研究S100A6參與肺癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

已有的研究也表明，S100A6在多種腫瘤組織和細(xì)胞均有表達(dá)，結(jié)直腸癌組織S100A6高表達(dá)與β-catenin和核纖層蛋白A/C(lamin A/C)形成相互作用，促進(jìn)了結(jié)直腸癌形成和發(fā)展[15]。Ohuchida等[16]發(fā)現(xiàn)S100A6可有效區(qū)分胰腺癌和慢性胰腺炎，是用于評價(jià)胰腺惡性潛能的標(biāo)志物和影響胰腺癌預(yù)后及生存的獨(dú)立因子。Tamai等[17]發(fā)現(xiàn)S100A6可能是MLL-AF4急性淋巴細(xì)胞白血病聯(lián)合異基因造血干細(xì)胞移植治療的有效靶點(diǎn)。S100A6 蛋白作為腫瘤檢測的標(biāo)志物在臨床上的應(yīng)用價(jià)值正日益受到重視，比如肝癌S100A6 蛋白的表達(dá)可有效的從肝細(xì)胞癌中鑒別出膽管癌，并且明顯優(yōu)于甲胎蛋白、癌胚抗原、糖抗原等目前臨床上常用的血清標(biāo)志物[18-19]。

S100A6調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能涉及復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，并與多種細(xì)胞因子相互作用有關(guān)。本研究中，我們采用R-T PCR和Western blot等研究方法初步明確了S100A6基因與蛋白在肺腺癌中的表達(dá)情況及其與肺腺癌臨床病理的關(guān)系，隨后我們將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步建立其在肺腺癌診斷中的靈敏度、特異度及陽性預(yù)測值，并將利用分子生物學(xué)技術(shù)最終闡明S100A6在肺癌發(fā)病過程的生物學(xué)機(jī)制。

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(本文編輯：張大春)

郎紅娟，姜華，金發(fā)光，等. 腫瘤相關(guān)基因S100A6在肺腺癌組織中表達(dá)及其臨床意義[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(5)： 574-578.

·論著·

【摘要】目的探討腫瘤相關(guān)基因S100A6在肺腺癌組織及肺腺癌細(xì)胞系的表達(dá)及其臨床意義。方法分別應(yīng)用RT-PCR和Western-blot方法對20例肺腺癌組織及其癌旁正常肺組織S100A6基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，比較肺癌組織和正常肺組織之S100A6表達(dá)有無差異，對肺癌組織S100A6表達(dá)與患者臨床病理特征相關(guān)性進(jìn)行分析；進(jìn)一步檢測A549人肺腺癌細(xì)胞系S100A6基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果肺腺癌組織S100A6 mRNA表達(dá)相對比值為0.77±0.39，癌旁正常肺組織S100A6 mRNA 表達(dá)相對比值為0.15±0.08，二者比較差異具有顯著性(P<0.05)；Western-blot分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織S100A6蛋白表達(dá)相對比值為0.76±0.19，癌旁正常肺組織S100A6蛋白表達(dá)相對比值為0.29±0.15，二者比較差異具有顯著性(P<0.05)；肺腺癌組織S100A6與患者臨床特征關(guān)系分析顯示，在大于或等于60歲和小于60歲的兩個(gè)年齡組患者中S100A6 mRNA和蛋白表達(dá)均無顯著性差異(P>0.05)，在男、女兩組患者之間無顯著性差異(P>0.05)；而吸煙指數(shù)大于或等于200組患者S100A6 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于吸煙指數(shù)小于200組患者(P<0.05)；ⅢⅣ分期組S100A6 mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于Ⅲ分期組(P<0.05)；A549人肺腺癌細(xì)胞系S100A6基因和蛋白可穩(wěn)定高表達(dá)。結(jié)論S100A6在肺腺癌中明顯高表達(dá)，且與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望作為肺腺癌的重要生物標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】S100A6；肺腺癌；標(biāo)志物，腫瘤；發(fā)病機(jī)制

Expression and clinical significance of tumor-associated S100A6 gene in lung adenocarcinomaLangHongjuan1,JiangHua1,JinFaguang1,YangShuanying2,NanYandong1.1DepartmentofRespiratoryMedicine,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,SecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaoTongUniversity,Xi′an710004,China

Correspondingauthor：NanYandong,Email：nanyandong2008@163.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of tumor-associated gene S100A6 in lung adenocarcinoma. MethodsIt was detected that the gene and protein expression of S100A6 in 20 cases of lung adenocarcinoma tissue and paraneoplastic normal lung tissue by RT-PCR and Western-blot, it was analyzed that the correlation between the clinical and pathological features and the expression of S100A6 gene and tested the expression of S100A6 gene in human lung adenocarcinoma A549 cell. ResultsThe relative expression amount of S100A6 mRNA in lung adenocarcinoma tissues and in paraneoplastic normal lung tissues were 0.77±0.39 and 0.15±0.08, respectively and the difference between the two groups was significant (P<0.05); The relative expression amount of S100A6 protein in lung adenocarcinoma tissues and in paraneoplastic normal lung tissues were 0.76±0.19 and 0.29±0.15, respectively and the difference between the two groups was significant (P<0.05). S100A6 gene and protein high expression was significantly associated with staging of lung cancer and smoking index (P<0.05), but not with age and gender (P>0.05). The gene and protein expression of S100A6 were stable and high in A549 cells. ConclusionsThe high expression of S100A6 gene in lung adenocarcinoma is closely related to tumor development and is expected as an important biomarker for lung cancer.

【Key words】S100A6;Lung adenocarcinoma;Biomarker;Pathogenesis

收稿日期：(2015-03-20)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：中圖法分類號： R563，R734.2 A

通訊作者：南巖東， Email：nanyandong2008@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81001040)；第四軍醫(yī)大學(xué)優(yōu)秀文職人員基金(2011-01)；

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.05.009