蚯蚓自溶酶對菜粕中植物蛋白的影響

（河北省遷安市第一中學(xué)064400）

蚯蚓自溶酶對菜粕中植物蛋白的影響

周麗娜（河北省遷安市第一中學(xué)064400）

蚯蚓體內(nèi)有極高活性的蛋白水解酶等酶類，利用這些酶水解自體蛋白，使之成為可溶性的小分子活性肽和氨基酸。蚯蚓中的氨基酸組成與禽畜體內(nèi)組織蛋白質(zhì)的氨基酸的組成相仿，并且水解產(chǎn)物中含有抗病和促進動物生長等多種功能的活性多肽。本實驗為研究蚯蚓對菜粕中的植物性蛋白的水解作用，為利用蚯蚓處理植物蛋白，生產(chǎn)新型高質(zhì)廉價飼料提供實驗依據(jù)。

蚯蚓自溶酶菜粕植物蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳

蚯蚓蛋白可作為優(yōu)質(zhì)蛋白飼料或作為飼料添加劑，而且能提高動物的免疫力。菜粕為常用的植物蛋白飼料，但其適口性差、消化吸收利用率低。本研究利用蚯蚓自溶酶水解蛋白質(zhì)的作用，將蚯蚓勻漿與菜粕在一定條件下混合反應(yīng)，得到較短肽鏈或氨基酸，從而改變蛋白質(zhì)原有結(jié)構(gòu)。最終得到一種新型的、成本低的、高品質(zhì)的蛋白飼料。

一、材料和方法

（一）儀器

勻漿打碎機，電熱鼓風(fēng)干燥箱，HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，冰箱，電子天平，KS康式振蕩器，DYY-ⅢⅠ型穩(wěn)壓電泳儀，JY-SCZ2型雙垂直板式電泳槽，TDL-60B離心機，燒杯200mL(16支)，50mL(16支)，小密封塑料袋（若干），離心管，容量瓶（50mL），棕色試劑瓶，培養(yǎng)皿，量筒，注射器，針頭，微量移液器。

（二）試劑

蒸餾水，0.9%NaCl溶液，0.1%NaCl溶液，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，三羥甲基氨基甲烷，1mol·L-1HCl，甘氨酸，十二烷基磺酸鈉，過硫酸銨，甘油，2-巰基乙醇，0.025%溴酚藍溶液，四甲基乙二胺，考馬斯亮藍R250，冰醋酸溶液，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

（三）試劑的配制

1．母液的配制：30%丙烯酰胺溶液：取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉雙丙烯酰胺，加水至100mL，過濾，棕色試劑瓶避光保存；

5mol·L-1Tris-HCl分離膠緩沖液，pH8.8（8X）：取18.15gTris，用1mol·L-1HCl調(diào)pH至8.8，加水至100mL，4℃保存；

1.0mol.L-1Tris-HCl濃縮膠緩沖液，pH6.8（8X）：取12gTris，用1mol·L-1HCl調(diào)pH至6.8，加水至100mL，4℃保存；

電極緩沖液，pH8.3（1X）：取28.8g甘氨酸，6.04gTris，加10mL 10%SDS，加水至1L，室溫保存；

10%SDS溶液：取10g SDS，加水至100mL，完全溶解后室溫保存；

10%過硫酸銨溶液：取0.1g過硫酸銨，加水至1mL，每次用前新鮮配制。

2．染色液的配制：考馬斯亮藍0.25%，甲醇50%，醋酸10%，加水至100%。

3．脫色液的配制：甲醇40%，醋酸10%，加水至100%。

4．標(biāo)準(zhǔn)蛋白的使用：開封后溶于200μL重蒸水，分裝于20個小管內(nèi)，再于每小管內(nèi)加入等體積的2倍樣品緩沖液，于沸水浴中加熱5min后，置于-20℃保存。使用前置室溫融化后，沸水浴中加熱3-5min。

5．樣品緩沖液(2X)的配制，見表1。（四）分離膠和濃縮膠的配制

1．分離膠（10%）的配制，見表2。

表1 樣品緩沖液制試劑用量表

表2 分離膠配制試劑表

2．濃縮膠（4%）的配制，見表3。

（五）步驟

1．鮮蚓（約500g）放在大燒杯中清洗，然后用勻漿打碎機將其打碎，得勻漿約500ml，加生理鹽水60ml，放在冰箱內(nèi)保存。

2．按表4的方法配制分組樣品，并在40℃下進行反應(yīng)。

表3 濃縮膠配制試劑表

表4 樣品配制

3．當(dāng)反應(yīng)分別進行到2h，4h，6h，8h時，分別從各組錐形瓶中取反應(yīng)產(chǎn)物5-6藥匙置于培養(yǎng)皿中，再將其放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中在溫度為55℃下烘干，然后將烘干物質(zhì)分別放在小塑料袋中，并進行標(biāo)記后放入冰箱內(nèi)保存，共得到不同配比、不同反應(yīng)時間的4組共16個樣品，以備后用。

4．分別從16個樣品塑料袋中取出干燥物質(zhì)0.2g放于16支錐形瓶中并標(biāo)記，分別加入10mL 0.1%NaCl溶液將錐形瓶置于振蕩器上振蕩浸提約1h。

5．離心：將浸提后的反應(yīng)物分別移入離心管中，標(biāo)記，放入離心機中在5000r·min-1的情況下離心5min，完畢，將上清液移入小試管中，標(biāo)記，放入冰箱保存，以備后用。

6．凝膠的灌制：安裝制膠板前用洗滌劑將玻璃板洗凈，將白塑料框下沿的窄縫用密封膠帶貼好，確保密封；把制膠板垂直放好，將新配制的分離膠溶液迅速用注射器緩慢加入制膠板之間，直至液面達到距梳子下緣1cm處。用注射器將蒸餾水注入分離膠上層，以隔絕空氣并使液面平整；分離膠聚合后，倒掉蒸餾水，用濾紙吸去殘液，用注射器迅速在制膠板中加滿新制濃縮膠溶液，插入相應(yīng)厚度的10齒梳子。

7．加樣：濃縮膠聚合后除去梳子、密封膠帶以及6個鐵夾。取出樣品離心后的上清液，用微量加樣器取樣并在梳井內(nèi)加樣。通常每個加樣孔上樣量20μg，將樣品體積20μL與樣品緩沖液20μL混合均勻，取適量加于加樣孔底部。完畢，將制膠板（2塊），電泳槽內(nèi)芯放入槽內(nèi)，使制膠板的玻璃板均與電泳槽內(nèi)芯接觸，然后插入楔型板以固定兩套制膠板。在內(nèi)外水槽加注電極緩沖液，使內(nèi)外水槽的液面均超過玻璃板上沿但低于塑料板上沿。

8．電泳：蓋好電泳槽上蓋，在100-150V電壓下電泳2h，直至樣品指示劑到達玻璃板的下緣，關(guān)閉電源，拔掉楔型板，取下制膠板，用刀片將濃縮膠切掉，將分離膠的左上角切掉一小角以標(biāo)記樣品順序。

9．染色：將電泳好的凝膠板取出，手帶橡膠手套將凝膠小心移入染色器皿中。加入考馬斯亮藍染液R250，加蓋，在搖床上染色2h。將染色液倒出，加入100mL脫色液，脫色3h。

10．將反應(yīng)物蛋白質(zhì)電泳結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)蛋白電泳結(jié)果進行比較大致確定反應(yīng)產(chǎn)物中所含蛋白質(zhì)。

二、結(jié)果

（一）按表4的方法配制4組樣品按不同的反應(yīng)時間取樣，編號見表5

（二）低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的組成及分子量，見表6

表5 各組樣品按不同反應(yīng)時間的取樣編號

表6 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的組成

（三）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及按表5取樣的電泳結(jié)果，見圖1和圖2

圖1 樣1-樣8的電泳結(jié)果

圖2 樣9-樣16電泳結(jié)果

（四）蚯蚓自溶酶對菜粕中植物蛋白的影響

從樣品的電泳結(jié)果可知，蚯蚓體內(nèi)的自溶酶等酶類對菜粕中植物性蛋白的水解作用隨著蚯蚓勻漿量的增加而增大；從反應(yīng)時間角度來看，隨著時間的延長，各組樣品的電泳條帶逐漸加長，即蚯蚓自溶酶等酶類對菜粕蛋白的水解程度加大。

三、討論

以上實驗結(jié)果表明，蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)自溶酶等酶類對植物性蛋白質(zhì)有較明顯的分解作用，利用蚯蚓自溶酶等酶類確實可以水解菜粕中的植物蛋白，菜粕蛋白被水解成小分子量的蛋白或短肽，蛋白結(jié)構(gòu)被改變，從而為將低質(zhì)蛋白原料開發(fā)為高效飼料蛋白提供了借鑒方法，為開發(fā)禽畜食用飼料提供了有效途徑。

[1]路英華,金汝娥.蚯蚓纖溶酶的提取、性質(zhì)鑒定和溶腺血的研究[J].蘭州大學(xué)學(xué)報,1986,22(1)∶95-100.

[2]程牛亮,王新亞,鄭國平等.雙胸蚯蚓纖溶酶Ⅱ的純化及性質(zhì)研究[J].生物化學(xué)雜志,1996,8(2)∶8-10.

（責(zé)編 趙建榮）