茉莉酸甲酯和磷酸氫二鉀誘導(dǎo)柱花草對(duì)炭疽病的抗性

伍康榮，劉鳳民，張偉麗，陳梓健，許戴奇，黎志輝，羅喜梅，林國(guó)森(.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 505； .仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院教學(xué)科研基地，廣東 廣州 505)

茉莉酸甲酯和磷酸氫二鉀誘導(dǎo)柱花草對(duì)炭疽病的抗性

伍康榮1，劉鳳民2，張偉麗1，陳梓健1，許戴奇1，黎志輝1，羅喜梅1，林國(guó)森1
(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510225； 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院教學(xué)科研基地，廣東 廣州 510225)

探究茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)和磷酸氫二鉀(K2HPO4)誘導(dǎo)柱花草對(duì)炭疽病的抵抗作用。結(jié)果表明,二者濃度分別為0.001～0.1 mg·mL-1和10～50 mmol·L-1時(shí),病情指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，最佳誘導(dǎo)濃度分別是0.001 mg·mL-1和30 mmol·L-1，誘導(dǎo)效果分別是64.84 %和54.40 %。0.001 mg·mL-1MeJA處理組的過(guò)氧化物酶(POD)及多酚氧化酶(PPO)活性在48 h達(dá)到最大值，顯著高于對(duì)照組。30 mmol·L-1K2HPO4處理組的POD與PPO活性分別在48和24 h達(dá)到最大值，顯著高于對(duì)照組。兩種誘抗劑處理的POD和PPO活性在接種早期增加了柱花草對(duì)炭疽菌的侵染的抵御能力，進(jìn)而提高植株的抗病性。30 mmol·L-1K2HPO4處理組的過(guò)氧化氫酶(CAT)活性在48～72 h內(nèi)上升，顯著高于對(duì)照組,而0.001 mg·mL-1MeJA處理組的CAT活性除72 h顯著低于對(duì)照組，其他時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相差不大。說(shuō)明在誘導(dǎo)柱花草抗病性方面，兩種誘導(dǎo)抗性劑處理的誘抗效果與POD、PPO和CAT的酶活性的誘導(dǎo)的時(shí)間及程度有關(guān)。

柱花草；炭疽?。卉岳蛩峒柞?；磷酸氫二鉀；誘導(dǎo)抗性

柱花草(Stylosanthesguianesis)是熱帶地區(qū)一種廣泛種植的優(yōu)良牧草，我國(guó)于1962年從馬來(lái)西亞引種作為覆蓋作物，種植于海南橡膠園[1]。然而隨著柱花草廣泛種植，炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)已成為危害其主要病因，造成多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的種植嚴(yán)重減產(chǎn)[2-3]。目前防治炭疽病的手段主要是化學(xué)防治,但過(guò)度使用化學(xué)農(nóng)藥，會(huì)造成環(huán)境污染。利用植物誘導(dǎo)抗性防治植物病害，可以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，保護(hù)環(huán)境，是現(xiàn)代植物病害防治的一條重要途徑[4]。

茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)與磷酸氫二鉀(K2HPO4)都是常見(jiàn)的植物誘抗劑。關(guān)于利用兩者誘導(dǎo)植物抗性的研究已有報(bào)道[5-8]。但對(duì)于兩者誘導(dǎo)柱花草抗炭疽病的研究還未見(jiàn)有報(bào)道。為此，本研究利用茉莉酸甲酯和磷酸氫二鉀設(shè)置不同濃度對(duì)柱花草進(jìn)行誘導(dǎo),測(cè)定其過(guò)氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)與過(guò)氧化氫酶(CAT)等相關(guān)酶的活性,探究其中的誘導(dǎo)機(jī)理，為柱花草炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌種

本研究所用的柱花草品種為CIAT184(S.guianensiscv. Reyan No.2，CIAT184)，種子來(lái)源于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶牧草研究中心。用80 ℃的水處理柱花草種子3～5 min后，播種于滅菌盆土中，每隔15 d施一次0.2%(w/v)芭田復(fù)合肥，培養(yǎng)7周后備用。

菌株從廣西南寧畜牧研究所試驗(yàn)地取病樣，經(jīng)分離純化鑒定為膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)[9]。將膠孢炭疽菌接種于PDA培養(yǎng)基中，放置于28 ℃培養(yǎng)4～5 d后，將產(chǎn)生的孢子配成1×106個(gè)·mL-1的懸浮液(加0.1%吐溫)備用。

1.2 主要試劑

茉莉酸甲酯(Sigma)：用少量的丙酮溶解后，用蒸餾水配置成1 mg·mL-1母液備用。磷酸氫二鉀(廣東西隴化工廠,分析純)：用蒸餾水溶解配置成0.5 mol·L-1母液備用。根據(jù)需要的工作液濃度將母液用蒸餾水稀釋。

1.3 誘導(dǎo)處理方法

茉莉酸甲酯分別設(shè)置0.001、0.01、0.1 mg·mL-13個(gè)不同濃度。K2HPO4分別設(shè)置10、30、50 mmol·L-13個(gè)不同濃度。每種處理選用15株柱花草，每種處理重復(fù)3次。將不同濃度的茉莉酸甲酯溶液(加0.1%吐溫)和K2HPO4溶液均勻噴灑在已培養(yǎng)7周的柱花草葉片上，直到有水滴流下為止，對(duì)照組噴灑蒸餾水(加0.1%吐溫)。培養(yǎng)3 d后，用配制好的膠孢炭疽菌孢子懸浮液(加0.1%吐溫)均勻地噴灑到植株葉片直至有水滴流下為止。將接種后的植株套袋保濕，放于人工氣候箱中培養(yǎng)48 h(白天28 ℃，14 h；夜間25 ℃，10 h)，48 h后除去保濕袋，繼續(xù)培養(yǎng)8 d后統(tǒng)計(jì)病害級(jí)數(shù)及病情指數(shù)。

1.4 病害統(tǒng)計(jì)方法[10]

觀察每棵植株的3位葉,按葉片6級(jí)法劃分(0級(jí),無(wú)癥狀；1級(jí),病斑的直徑<0.5 mm；2級(jí),病斑的直徑在0.5～1.0 mm；3級(jí),病斑的直徑在1.0～2.0 mm；4級(jí),50%葉片壞死；5級(jí),葉片完全枯萎或脫離)統(tǒng)計(jì)每片葉的病級(jí)數(shù)。每棵植株病級(jí)數(shù)= (L0+ L1+ L2)/3(L0為接種時(shí)最后出來(lái)的那片未完全展開(kāi)葉的病級(jí)數(shù)；L1為接種時(shí)最上面的完全展開(kāi)葉的；L2為接種時(shí)第2片完全展開(kāi)葉的)。按如下公式計(jì)算病情指數(shù)與誘抗效果：

病情指數(shù)=

1.5 酶活性的測(cè)定

1.5.1 試驗(yàn)處理 選取濃度為0.001 mg·mL-1茉莉酸甲酯、30 mmol·L-1K2HPO4處理植株,具體處理方法同1.3，再均勻噴灑已配置好的膠孢炭疽菌孢子懸浮液(加0.1%吐溫)后，分別在0、24、48、72和96 h取植株頂端的三位葉測(cè)酶活性。

1.5.2 過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定 參考張偉麗等[9]方法取0.4 g柱花草葉子置于研缽中，加入4 mL預(yù)冷的50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.0)，加少量石英砂和0.1 mL 2 g·L-1PVP，置于冰上研磨，在4 ℃、10 000 g離心20 min，取上清液測(cè)定可溶性POD的活性。將提取完可溶性POD的沉淀物用1%Triton-100和去離子水洗滌。然后在沉淀物中加4 mL 1 mol·L-1NaCl溶液，25 ℃保溫過(guò)夜，在4 ℃、10 000 g離心20 min。取上清液測(cè)定離子鍵與壁結(jié)合的POD活性(iPOD)。用1 mol·L-1NaCl溶液和去無(wú)離子水洗滌提取完iPOD的沉淀物。然后在沉淀物中加4 mL的0.1 mol·L-1的醋酸緩沖液(pH 5.6，含0.5%纖維素酶和2.5%果膠酶)，25 ℃保溫過(guò)夜，離心。取上清液測(cè)定共價(jià)鍵與壁結(jié)合的POD活性(cPOD)。采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性[11]。定義1個(gè)酶活單位(U)為：1 min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需要的酶量。

1.5.3 多酚氧化酶(PPO)活性測(cè)定 取0.4 g柱花草葉子置于研缽中，加入4 mL預(yù)冷的50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.0)，加少量石英砂和0.1 mL 2 g·L-1的PVP，冰上研磨，在4 ℃、10 000 g離心20 min，取上清液用鄰苯二酚法[11]來(lái)測(cè)定PPO酶活性。定義1個(gè)酶活單位(U)為:每1 min內(nèi)A416 nm變化0.1為1 U。

1.5.4 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定 取0.4 g柱花草葉子置于研缽中，加入4 mL預(yù)冷的50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.0)，加少量石英沙和0.1 mL 2 g·L-1的PVP，冰上研磨，在4 ℃、10 000 g離心20 min，取上清液用參照Kraus和Fletcher[12]方法來(lái)測(cè)定CAT酶活性。定義1個(gè)酶活單位(U)為：1 min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需要的酶量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用DPS軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測(cè)定結(jié)果，對(duì)病情指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 K2HPO4和MeJA的誘抗效果

K2HPO4各濃度處理組與對(duì)照組(CK)之間差異顯著(P<0.05)，并且各濃度處理之間也差異顯著，30 mmol·L-1處理效果最好，誘抗效果達(dá)54.40%，10 mmol·L-1次之，50 mmol·L-1效果最差；MeJA處理組相互之間差異顯著(P<0.05)，與對(duì)照組之間差異也顯著，誘導(dǎo)效果最好濃度為0.001 mg·mL-1，誘抗效果達(dá)64.84%(表1)。選用誘抗效果最好的濃度30 mmol·L-1K2HPO4和0.001 mg·mL-1MeJA進(jìn)行防御酶試驗(yàn)。

2.2 可溶性POD活性的變化

0.001 mg·mL-1MeJA處理組的可溶性POD活性隨時(shí)間逐步上升，而后略有下降(圖1)。48 h的可溶性POD活性最高，是同時(shí)期CK的1.49倍，并且在48、72和96 h的酶活性都顯著高于CK(P<0.05)，但CK的可溶性POD的活性也隨時(shí)間有所上升，24 h升至最高，此時(shí)的酶活性與MeJA處理組無(wú)顯著差異(P>0.05)。30 mmol·L-1K2HPO4處理組的可溶性POD活性是先上升后下降再上升的趨勢(shì)，在48 h顯著高于CK，但在24 h顯著低于CK。

表1 不同濃度的K2HPO4和MeJA對(duì)柱花草炭疽病的誘抗效果Table 1 Effects of induced resistance against infection byC.gloeosporiodesonS.guianesisafter treated by MeJA and K2HPO4at different concentrations

注:同列不同字母表示同一誘導(dǎo)劑不同濃度之間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lower case letters in the same inducer indicate significant difference among different concentrations at 0.05 level.

圖1 MeJA和K2HPO4誘抗炭疽菌處理后可溶性過(guò)氧化物酶(POD)的變化Fig.1 Changes of soluble POD activity inS.guianensisafter treated by MeJA and K2HPO4

注：不同小寫(xiě)字母表示相同時(shí)間不同處理間的顯著性差異(P<0.05)。圖2、圖3、圖4和圖5同。

Note: Different lower case letters for the same time show significant differences among different treatments at 0.05 level. The same in Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, and Fig. 5.

2.3 細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)合態(tài)POD活性變化

0.001 mg·mL-1MeJA處理組的細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)合態(tài)POD活性隨時(shí)間先上升后下降，然后又略有上升(圖2)。24 h的細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)合態(tài)POD活性最高，是同時(shí)期CK的2.94倍，并且差異顯著(P<0.05)，而其他時(shí)間點(diǎn)與CK沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。30 mmol·L-1K2HPO4處理的細(xì)胞壁結(jié)合態(tài)POD活性在72 h顯著低于CK，其他時(shí)間點(diǎn)的酶活性與CK相差不大。

圖2 MeJA和K2HPO4誘抗炭疽菌處理后細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)合態(tài)POD(cPOD)活性變化Fig.2 Changes of cPOD activity inS.guianensisafter treated by MeJA and K2HPO4

2.4 細(xì)胞壁離子結(jié)合態(tài)POD活性變化

0.001 mg·mL-1MeJA處理組的離子結(jié)合態(tài)POD活性在24 h升至最高(圖3)，是同時(shí)期CK的2.65倍，而后略有下降，除0 h外，其他時(shí)間點(diǎn)的酶活性都顯著高于同時(shí)期CK處理組(P<0.05)。30 mmol·L-1K2HPO4處理組的離子結(jié)合態(tài)POD酶活性在0 h至72 h與CK都相差不大，沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，在96 h顯著高于同時(shí)期CK。

圖3 MeJA和K2HPO4誘抗炭疽菌處理后細(xì)胞壁離子結(jié)合態(tài)POD(iPOD)活性變化Fig.3 Changes of iPOD activity inS.guianensisafter treated by MeJA and K2HPO4

2.5 PPO活性的變化

0.001 mg·mL-1MeJA處理柱花草后的PPO活性在48 h升至最高(圖4)，顯著高于同時(shí)期CK(P<0.05)，此時(shí)酶活性為CK的2.64倍。30 mmol·L-1K2HPO4處理柱花草后的PPO活性的除24 h顯著高于對(duì)照，其余與CK無(wú)顯著差異。此時(shí)，CK與K2HPO4處理組的PPO活性都是在24 h升高至最高，K2HPO4處理組的PPO活性是CK的1.50倍。

2.6 CAT活性的變化

0.001 mg·mL-1的MeJA處理柱花草后的CAT活性除了在24和96h比CK略高(圖5)，其他時(shí)間點(diǎn)的CAT活性都比CK低，并且在72 h顯著低于CK(P<0.05)。30 mmol·L-1K2HPO4處理柱花草后的CAT活性先略有下降，而后逐漸升高，72 h升至最高，是同時(shí)期CK的1.82倍，隨后下降。48和72 h的CAT活性顯著高于同時(shí)期CK(P<0.05)。

圖4 MeJA和K2HPO4誘抗炭疽菌處理后多酚氧化酶活性(PPO)的變化Fig.4 Changes of PPO activity inS.guianensisafter treated by MeJA and K2HPO4

圖5 MeJA和K2HPO4誘抗炭疽菌處理后過(guò)氧化氫酶活性的變化(CAT)Fig.5 Changes of CAT activity inS.guianensisafter treated by MeJA and K2HPO4

3 討論與結(jié)論

系統(tǒng)獲得抗性是植物抵抗病菌入侵的重要的防御系統(tǒng)，可以通過(guò)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生這種抗性[13]。不同病原菌入侵植物體會(huì)產(chǎn)生不同反應(yīng)，但基本都會(huì)經(jīng)歷信號(hào)的產(chǎn)生、識(shí)別、傳遞和轉(zhuǎn)化等幾個(gè)階段[14]。很多研究表明，茉莉酸(酯)類(lèi)物質(zhì)與植物的抗性有密切的關(guān)系，可作為內(nèi)源信號(hào)分子參與植物如抗病、抗蟲(chóng)及抗旱等抗逆性反應(yīng)[15]。Vijayan等[16]報(bào)道當(dāng)病原體入侵?jǐn)M南芥(Arabidopsisthaliana)后，擬南芥的體內(nèi)JA含量升高，激活相關(guān)的抗病基因表達(dá)蛋白以產(chǎn)生抗病作用。磷酸氫二鉀也是一種非常重要的無(wú)機(jī)類(lèi)化學(xué)誘抗劑。張偉麗等[9-10]研究表明,POD、PPO和CAT與柱花草抗炭疽病相關(guān)。

在本研究中，MeJA處理柱花草后，在接種病菌24～48 h內(nèi)，可溶性POD、共價(jià)結(jié)合態(tài)POD(cPOD)和離子結(jié)合態(tài)POD(iPOD)的活性都大幅度增加，達(dá)到最高，而且顯著高于同時(shí)期的對(duì)照組(P<0.05)。MeJA處理柱花草接種病菌后，POD受到較早時(shí)間的誘導(dǎo)使植物體進(jìn)入防御階段，因此降低發(fā)病率。也說(shuō)明了柱花草抗病性與POD有一定的關(guān)系，與向妙蓮等[17]研究的結(jié)果相符合。K2HPO4處理柱花草后，接種病菌48 h，可溶性POD達(dá)到最高，但cPOD和iPOD卻與對(duì)照相差不大。K2HPO4對(duì)可溶性POD的誘導(dǎo)作用比cPOD和iPOD好。

PPO普遍存在于植物中，能夠?qū)⒎宇?lèi)化合物催化醌類(lèi)化合物，而醌類(lèi)化合物對(duì)入侵植物體的病菌有毒害作用，從而保護(hù)植物[18]。MeJA和K2HPO4處理柱花草后，在接種病菌后，前者48 h PPO都達(dá)到了最高值，而后者在24 h達(dá)到最高，而且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。但K2HPO4誘導(dǎo)PPO的時(shí)間更短，活性更高。因此，說(shuō)明兩者在接種早期都提高了PPO的活性，進(jìn)而抵御了炭疽菌對(duì)柱花草的侵染，提高了植株的抗病性。

植物體內(nèi)的CAT主要作用是催化H2O2，既可以作為信號(hào)因子誘導(dǎo)植物抗病反應(yīng)，也可以起到直接病菌作用，CAT的活性與H2O2成反比，并且過(guò)多的H2O2會(huì)對(duì)植物體造成傷害[19]。K2HPO4處理柱花草接種病菌后，CAT活性先降低，從24～72 h之間持續(xù)上升，過(guò)程是先積累H2O2防御病菌入侵，然后CAT活性升高催化較多的H2O2，至96 h下降，防止植物體受傷害。而MeJA處理組剛好相反，在24 h CAT活性先升高，后面的其他都時(shí)間降低，表現(xiàn)為較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)積累H2O2防御病菌入侵。結(jié)果說(shuō)明這兩種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)CAT的反應(yīng)機(jī)制不同。

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(責(zé)任編輯 張瑾)

The resistance ofStylosanthesguianesistoColletotrichumgloeosporioidesinduced by methyl jasmonate and K2HPO4

WU Kang-rong1, LIU Feng-min2, ZHANG Wei-li1, CHEN Zi-jian1, XU Dai-qi1, Li Zhi-hui1, LUO Xi-mei1, LIN Guo-sen1
(1.College of Life Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2.Teaching and Science Research Base, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China)

The effects of methyl jasmonate (MeJA) and K2HPO4on induced resistance ofStylosanthesguianesiscv CIAT184 toColletotrichumgloeosporioideswere studied. The results indicated that the disease indexes ofS.guianesisdecreased significantly (P<0.05) by treatments of MeJA with concentration ranged from 0.001 to 0.1 mg·mL-1and K2HPO4with concentration ranged from 10～50 mmol·L-1. The optimal concentration of MeJA and K2HPO4treatment was 0.001 mg·mL-1and 30 mmol·L-1, respectively, which had induced effects of 64.84% and 54.40%, respective. The activities of POD and PPO in plants treated with 0.001 mg·mL-1MeJA increased and reached maximum at 48 hour after inoculation, which were significantly (P<0.05) higher than those in control plant without MeJA. The activities of POD and PPO in plants treated with 30 mmol·L-1K2HPO4increased and reached maximum at 48 hour and 24 hour after inoculation, respectively, which were significantly (P<0.05) higher than those in control plants without K2HPO4. These results suggested that MeJA and K2HPO4increased the activities of antioxidant enzymes like POD and PPO in the early stage after inoculation to improve the resistance ofS.guianesisto anthracnose after inoculation. The activities of CAT in plants treated with 30 mmol·L-1K2HPO4increased from 48 hour to 72 hour after inoculation, which were significantly (P<0.05) higher than those in control plants without K2HPO4. However, the activities of CAT in plants treated with 0.001 mg·mL-1MeJA were similar with those in control plants without MeJA excepted with the former one was significantly (P<0.05) lower than later one at 72 hour after inoculation. These results indicated that the induced effects of these two chemicals on the disease resistance ofS.guianesistoC.gloeosporioideswere related with the activities and induced time of POD, PPO and CAT.

Stylosanthesguianesis;Colletotrichumgloeosporioides; methyl jasmonate; K2HPO4; induced resistance

ZHANG Wei-li E-mail:zhangweili7218@163.com

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0410

2014-09-11 接受日期：2015-03-03

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2011010000435)

伍康榮(1988-)，男，廣東湛江人，在讀碩士生，研究方向?yàn)橹参锟共∩砑胺肿訖C(jī)理。E-mail:wkrrong@163.com

張偉麗(1969-)，女，河北樂(lè)亭人，教授，碩導(dǎo)，博士，研究方向?yàn)橹参锟共∩砑胺肿訖C(jī)理研究。E-mail：zhangweili7218@163.com

S435.4

A

1001-0629(2015)07-1124-06*

伍康榮,劉鳳民,張偉麗,陳梓健,許戴奇,黎志輝,羅喜梅,林國(guó)森.茉莉酸甲酯和磷酸氫二鉀誘導(dǎo)柱花草對(duì)炭疽病的抗性[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(7):1124-1129.

WU Kang-rong,LIU Feng-min,ZHANG Wei-li,CHEN Zi-jian,XU Dai-qi,Li Zhi-hui,LUO Xi-mei,LIN Guo-sen.The resistance ofStylosanthesguianesistoColletotrichumgloeosporioidesinduced by methyl jasmonate and K2HPO4[J].Pratacultural Science,2015,32(7)：1124-1129.