顯色劑加入方式及結(jié)果計(jì)算方法對(duì)土壤磷酸酶測(cè)定結(jié)果的影響

貝美容+羅雪華+楊紅竹

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所 海南儋州 571737）

摘 要 為探討有色顯色劑的加液方式及加入量對(duì)顯色后溶液吸收值的影響、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制及結(jié)果計(jì)算方法對(duì)土壤磷酸酶測(cè)定值的影響，取廣東橡膠園0～20 cm土樣為材料，以磷酸苯二鈉為基質(zhì)，酶解土壤釋放出酚，與顯色劑氯代二溴對(duì)苯醌亞胺反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法求出樣品測(cè)試液的酚濃度，比較以不同加液方式加入不同量的顯色劑對(duì)溶液吸收值的影響，同時(shí)比較用直線(xiàn)或一元二次曲線(xiàn)等兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程對(duì)樣品測(cè)試液酚濃度的影響。結(jié)果表明：以膠頭滴管滴加或以移液槍用多次重復(fù)使用過(guò)的吸嘴加入顯色劑，顯色后溶液吸收值變異系數(shù)達(dá)3.33%～6.44%，而以活塞式定量加液器加入，其變異系數(shù)在1.28%以下，且隨著加入量增大變異系數(shù)降低至0.51%，重現(xiàn)性好；當(dāng)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)濃度范圍較寬且相應(yīng)吸收值較高（接近0.9），以曲線(xiàn)法求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程決定系數(shù)（R2=0.999 8）大于直線(xiàn)回歸的（R2=0.999 7），且曲線(xiàn)法求出的土壤無(wú)基質(zhì)對(duì)照及試劑空白酚濃度比直線(xiàn)法更有實(shí)際意義。

關(guān)鍵詞 土壤磷酸酶 ；顯色劑 ；定量加液器 ；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) ；結(jié)果計(jì)算

分類(lèi)號(hào) O657

Abstract Effects of color development reagent dosing methods and dosing volumes on absorbance were investigated in this study， and effects of calculation methods on final values were also discussed in this study. Soil samples were collected in Guangdong rubber plantation from 0～20 cm layer， benzene disodium phosphate as the reactant， and chlorinated dibromo benzoquinoneimine as the color development reagent， the phenol concentration of tested sample solution be calculated using the standard curve methods. The effects of different dosing methods and dosing volumes of color development reagent on absorbance were compared and the phenol concentrations of tested sample solution were compared with linear or quadratic curve regression equation. The results showed that the coefficient of variation （CV） of the absorbance value ranged from 3.33% to 6.44% after adding different amounts of color development reagent using rubber dropper or pipette with continuous used tips， and CV was less than 1.28% using a piston dispenser， and CV was reduced to 0.51% with the amounts of the color reagent increasing. When standards of desired concentration range were wide， and the highest point of the standard series had a higher absorbance value， for example， the absorbance value of the highest standard closed to 0.9 in this experiment， the coefficient of determination of the standard curve regression equation based on a quadratic fit （R2=0.999 8） was higher than on a linear fit（R2=0.999 7） ， and the phenol concentration of tested blank without disodium phenyl phosphate and the reagent blank were more meaningful using the regression equation based on a quadratic fit than based on a linear fit.

Keywords soil phosphatase ； color reagent； piston dispenser ； standard curve ； result calculation

土壤有機(jī)磷是土壤全磷的重要組成部分，約占土壤全磷的30%～80%[1-2]，但有機(jī)磷必須在土壤磷酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷后才能被植物吸收利用，因而土壤磷酸酶的活性直接影響土壤中磷的有效性。而土壤磷酸酶活性的準(zhǔn)確定量是正確評(píng)價(jià)土壤有機(jī)磷轉(zhuǎn)化強(qiáng)度和方向的前提和基礎(chǔ)。常用的土壤磷酸酶活性測(cè)定方法是通過(guò)向土壤中添加苯基磷酸鹽等基質(zhì)，然后以比色法測(cè)定在磷酸酶的作用下水解后所生成的有機(jī)基團(tuán)即苯酚的量，即為酶促基質(zhì)形成產(chǎn)物的數(shù)量[2-5]。

由于土壤中存在一些與基質(zhì)分解產(chǎn)物相似的化合物（如酚等）及基質(zhì)自發(fā)分解的產(chǎn)物，它們將直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，在測(cè)定土壤磷酸酶活性時(shí)，都必須設(shè)置無(wú)基質(zhì)對(duì)照和無(wú)土壤對(duì)照，計(jì)算酶活性時(shí)從試驗(yàn)樣品數(shù)據(jù)中減去對(duì)照樣品的，但在具體的顯色、比色等操作步驟中，由于顯色劑本身有顏色，顯色劑的加入量、加液方式、參比溶液的選擇，均會(huì)影響酶活性測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]，甚至因參比溶液選擇不當(dāng)導(dǎo)致結(jié)果計(jì)算時(shí)出現(xiàn)土壤酶活性為負(fù)值的現(xiàn)象。針對(duì)上述問(wèn)題， 我們從顯色劑的配制、移取方法、參比溶液的選擇及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制、結(jié)果計(jì)算等方面對(duì)該法作了一些研究，供分析實(shí)驗(yàn)人員參考，以提高分析樣品的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

廣東橡膠園土壤0～20 cm土樣，3種不同的土質(zhì)，基本情況見(jiàn)表1。

1.1.2 儀器

恒溫培養(yǎng)箱；Lambda系列紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.1.3 試劑、標(biāo)準(zhǔn)系列

試劑均為分析純；水為蒸餾水。甲苯；pH 5.0醋酸鹽緩沖液；0.5%的基質(zhì)溶液；pH 9.6硼砂-氫氧化鈉緩沖液；顯色劑；1 g/L酚原液；10 mg/L酚工作液。

1.2 方法

1.2.1 試劑、標(biāo)準(zhǔn)系列的配制

（1）pH 5.0醋酸鹽緩沖液：分別取貯備液A 14.8 mL、貯備液B 35.2 mL，以水稀釋至100 mL；貯備液A：0.2 mol/L醋酸溶液，即取95%的醋酸11.55 mL加水稀釋至1 L；貯備液B：0.2 mol/L醋酸鈉溶液，即取16.4 g醋酸鈉（CH3COONa）或27.2 g CH3COONa·3H2O，加水溶解后稀釋至1 L。

（2）0.5%的基質(zhì)溶液：取5.826 g苯磷酸二鈉（C6H5PO4Na2·2H2O） 溶于pH 5.0的醋酸鹽緩沖液并稀釋至1 L。

（3）pH 9.6硼砂-氫氧化鈉緩沖液：分別取貯備液C 50 mL、貯備液D 23 mL，以水稀釋至200 mL；貯備液C：0.05 mol/L硼砂溶液，即取19.05 g硼砂（Na2B4O7·10H2O）加水溶解后稀釋至1 L；貯備液D：0.2 mol/L氫氧化鈉溶液，即取8.0 g 氫氧化鈉（NaOH）加水溶解后稀釋至1 L。

（4）顯色劑：取0.062 5 g 2.6-二溴苯醌氯酰亞胺（C6H2Br2ClNO），用40 mL 95%乙醇溶解（原方法[5]：0.125 g 2.6-二溴苯醌氯酰亞胺用10 mL 95%乙醇溶解），貯于棕色瓶中，存放在冰箱里，保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用（最好現(xiàn)配現(xiàn)用）。

（5）1 g/L酚原液：取1 g重蒸酚溶于蒸餾水中，稀釋至1 L，貯于棕色瓶中。

（6）10 mg/L酚工作液：取10 mL 酚原液稀釋至1 L。

1.2.2 測(cè)定原理

本法基于以苯磷酸二鈉為基質(zhì)，在pH 5.0醋酸鹽緩沖液的酸性條件下，使酶解土壤釋放出的酚與氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑反應(yīng)生色，比色后按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法求出游離的酚量，用以表示酶的活性。

1.2.3 酶活性的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的測(cè)定：取10 mg/L酚工作液0、0.5、1、2、3、5、7、8、9 mL置于25 mL容量瓶中，使用定量加液器每瓶分別加入2.5 mL pH 9.6的硼砂-氫氧化鈉緩沖液和1 mL顯色劑，顯色后以水稀釋至刻度，30 min后，于578 nm波長(zhǎng)處比色，用1 cm比色皿，以蒸餾水作參比溶液調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)，測(cè)定其吸收值，該標(biāo)準(zhǔn)系列溶液相應(yīng)酚濃度為：0、0.2、0.4、0.8、1.2、2、2.8、3.2、3.6 mg/L。

樣品的測(cè)定：稱(chēng)取過(guò)1 mm篩的風(fēng)干土樣2.5 g，置于150 mL三角瓶中，加1 mL甲苯，輕輕搖動(dòng)，15 min后，加入10 mL 0.5%的基質(zhì)溶液，仔細(xì)搖勻后以保鮮膜封口，放入37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。取出后加入90 mL水，搖勻，吸取10 mL離心，取1 mL清液于25 mL刻度試管，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所述方法顯色，此液即為加基質(zhì)樣品測(cè)試液（簡(jiǎn)稱(chēng)為加基質(zhì)樣品）；同時(shí)，每個(gè)土樣做無(wú)基質(zhì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，即以10 mL pH 5.0醋酸鹽緩沖液代替10 mL基質(zhì)溶液，其余操作與加基質(zhì)樣品同樣顯色，此液為無(wú)基質(zhì)對(duì)照測(cè)試液（簡(jiǎn)稱(chēng)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照），以排除土壤中原有的酚對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；同時(shí)與樣品實(shí)驗(yàn)相同方法做無(wú)土對(duì)照實(shí)驗(yàn)，即不加入土壤，其余操作與加基質(zhì)樣品同樣顯色，此液為無(wú)土對(duì)照測(cè)試液（簡(jiǎn)稱(chēng)試劑空白），以檢查試劑純度和基質(zhì)自生分解情況，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

因?yàn)轱@色劑本身是有顏色的，為比較不同量的顯色劑、不同加液方式對(duì)溶液吸收值的影響，分別用膠頭滴管、移液槍及活塞式定量加液器加入0.5、1、1.5 mL等不同量的顯色劑，以水定容至25 mL，測(cè)定其吸收值，每個(gè)處理重復(fù)4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色劑不同加入法對(duì)溶液吸收值的影響

不同量的顯色劑、不同加入方法對(duì)溶液吸收值的影響結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可以看出，不論是哪種加入法，隨著顯色劑加入量的不斷增加，溶液吸收值均不斷增大，因此在酶活性測(cè)定過(guò)程中必須十分嚴(yán)格控制顯色劑的加入量[7]，以準(zhǔn)確加入所需的顯色劑用量。

從表2中還可看出，用膠頭滴管和移液槍加入顯色劑，溶液吸收值的變異系數(shù)均大于3.33，且隨著顯色劑加入量的增大而增加至6.44，這可能是由于滴管加入，是由拇指和食指出力控制一滴一滴地加入，而每滴之間由于手控制力的差異，同時(shí)由于顯色劑濃度高、且溶劑為高濃度易揮發(fā)的酒精，每滴之間微量的差異將導(dǎo)致顯色后溶液吸收值的較大差異；而移液槍本身是精密儀器，但其塑料吸嘴由于重復(fù)使用，吸嘴尖端殘留量不一及內(nèi)壁易掛水珠等因素，致使移液槍加入法溶液的吸收值重復(fù)性也較差。

而活塞式加液器是利用注射器式針筒的柱塞往復(fù)運(yùn)動(dòng)和進(jìn)水口、出水口兩個(gè)單向活塞使液體定量、定向運(yùn)動(dòng)、進(jìn)行加液，所加試液在試液導(dǎo)出管內(nèi)相對(duì)較密閉，不存在液體揮發(fā)和掛壁現(xiàn)象，所以顯色后溶液吸收值變異系數(shù)在1.28%以下，且隨著顯色劑加入量由0.5 mL增至1.5 mL，其變異系數(shù)反而減小，重復(fù)性更好，故我們優(yōu)選活塞式定量加液器；同時(shí)降低顯色劑的配制濃度，即取0.062 5 g氯代二溴對(duì)苯醌亞胺溶解于40 mL 95%的乙醇、但顯色劑的加入量由文獻(xiàn)的5滴[5]（約0.25 mL）擴(kuò)大至1 mL，而總的氯代二溴對(duì)苯醌亞胺加入量保持不變，以減小測(cè)試誤差，提高樣品分析準(zhǔn)確性。

2.2 土壤磷酸酶活性計(jì)算方法

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液顯色后的吸收值分別為0.171、0.215、0.259、0.34、0.422、0.575、0.728、0.804、0.890。在由標(biāo)準(zhǔn)系列酚濃度及其相應(yīng)吸收值求樣品測(cè)試液的酚濃度時(shí)，在如今計(jì)算機(jī)普及的情況下，不用坐標(biāo)紙繪圖法，而參照一元線(xiàn)性回歸在比色分析中的應(yīng)用方法[8]，在Excel 2003或2007軟件中，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液酚濃度為自變量（x），相應(yīng)吸收值為因變量（y），插入XY散點(diǎn)圖后繪得回歸線(xiàn)，再選中該回歸線(xiàn)后在添加趨勢(shì)線(xiàn)的回歸分析類(lèi)型選項(xiàng)中，選擇線(xiàn)性或多項(xiàng)式及相應(yīng)的公式、R平方值等選項(xiàng)后，求得直線(xiàn)回歸方程：y=0.197 2 x+0.178 2，R2=0.999 7，或一元二次曲線(xiàn)回歸方程：y=-0.002 3 x2+0.205 5 x+0.174 8，R2=0.999 8。測(cè)定出的3種土壤加基質(zhì)樣品、無(wú)基質(zhì)對(duì)照及試劑空 白顯色后溶液的吸收值見(jiàn)表3。

由表3可知，3種土樣的A無(wú)及試劑空白A0雖然都較高（達(dá)到0.17），且與上述標(biāo)準(zhǔn)空白接近，說(shuō)明3種土樣的無(wú)基質(zhì)對(duì)照及試劑空白的酚含量接近標(biāo)準(zhǔn)空白，其吸收值較高是由于顯色液帶有顏色而引起的。

由各土樣顯色后溶液吸收值依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程求解擬合，求出其相應(yīng)酚濃度C，平均值見(jiàn)表3，最后根據(jù)公式⑴求出各土壤樣品磷酸酶活性，見(jiàn)表4。

由表4可知，用直線(xiàn)回歸方程（簡(jiǎn)稱(chēng)直線(xiàn)法）求出3種土樣的無(wú)基質(zhì)對(duì)照及試劑空白的酚濃度在-0.006～-0.020，全部為負(fù)值，而由曲線(xiàn)回歸方程（簡(jiǎn)稱(chēng)曲線(xiàn)法）求出3種樣品的無(wú)基質(zhì)對(duì)照及試劑空白的酚濃度在-0.002～0.011，其中也出現(xiàn)了負(fù)值，這可能是回歸方程引入的一個(gè)固定的誤差[9-10]，并非負(fù)濃度，說(shuō)明3種土樣本身所含酚類(lèi)物質(zhì)都較低，基質(zhì)的自發(fā)分解也很弱，但曲線(xiàn)法求出3種土樣的無(wú)基質(zhì)對(duì)照及試劑空白的酚濃度比直線(xiàn)法更接近于正值，更有實(shí)際意義；且由于本實(shí)驗(yàn)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)濃度范圍較寬，最高點(diǎn)酚濃度為0.36 mg /L，其吸收值相應(yīng)較高（接近0.9），以曲線(xiàn)法求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程決定系數(shù)（R2=0.999 8）大于直線(xiàn)回歸的（R2=0.999 7），因此選擇曲線(xiàn)法求出的各土樣待測(cè)液的酚濃度進(jìn)行計(jì)算，以表征土壤磷酸酶活性。

3 討論與結(jié)論

土壤酶活性的測(cè)定與土壤常規(guī)分析略有不同，在土壤酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，除了需設(shè)置試劑空白，每個(gè)土樣還需設(shè)置無(wú)基質(zhì)對(duì)照，若測(cè)定方法中顯色劑本身是有顏色的（如本法土壤磷酸酶的測(cè)定），測(cè)試中建議以蒸餾水為參比溶液調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)，測(cè)出加基質(zhì)樣品、無(wú)土對(duì)照及試劑空白測(cè)試液的吸收值，再依據(jù)回歸方程擬合求出其酚濃度；另外在測(cè)試未知土壤的磷酸酶活性時(shí)，若配制了濃度范圍較寬的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，其最高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收值較高時(shí)，如本試驗(yàn)最高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收值接近0.9，建議以一元二次回歸方程擬合求解樣品測(cè)試液的酚濃度。

本實(shí)驗(yàn)以蒸餾水為參比溶液調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)的好處在于：對(duì)于顯色劑本身是有顏色的情況下，能夠測(cè)知標(biāo)準(zhǔn)空白測(cè)試液及無(wú)土對(duì)照測(cè)試液（即試劑空白）的吸收值高低；當(dāng)空白測(cè)試液的吸收值過(guò)大時(shí)，結(jié)果計(jì)算時(shí)就不能采用扣除空白值的校正方法，而應(yīng)當(dāng)純化試劑、提高蒸餾水質(zhì)量等方法改進(jìn)；若直接以標(biāo)準(zhǔn)空白或試劑空白為參比溶液調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)，雖可消除顯色試劑中的待測(cè)組分產(chǎn)生吸收的影響，但很難發(fā)現(xiàn)試劑空白值的大小。

對(duì)于土壤磷酸酶活性測(cè)定方法中易揮發(fā)溶劑配制的帶有顏色的顯色劑，必須十分嚴(yán)格控制顯色劑的加入量，使用加液路徑相對(duì)較密閉的活塞式定量加液器，同時(shí)適當(dāng)降低顯色劑的配制濃度以擴(kuò)大加入量，減小因量小濃度高而造成的誤差，提高樣品分析的精密度和準(zhǔn)確度。

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