降香黃檀不同混交林土壤細(xì)菌多樣性差異分析

楊 菁, 周國(guó)英,田媛媛, 劉倩麗, 劉成鋒, 楊 權(quán), 周潔塵

經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中南林業(yè)科技大學(xué)，長(zhǎng)沙 410004

降香黃檀不同混交林土壤細(xì)菌多樣性差異分析

楊 菁, 周國(guó)英*,田媛媛, 劉倩麗, 劉成鋒, 楊 權(quán), 周潔塵

經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中南林業(yè)科技大學(xué)，長(zhǎng)沙 410004

為探討降香黃檀不同混交林土壤細(xì)菌的多樣性及其與土壤性質(zhì)的關(guān)系，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)，比較降香黃檀(DalbergiaodoriferaT.Chen)分別與奧氏黃檀(Dalbergiaoliveri)、大果紫檀(Pterocarpusmacarocarpus)、檀香(SantalumalbumL.)和母生(HomaliumhainanenseGagnep.)混交的4種模式土壤細(xì)菌多樣性，并結(jié)合土壤的理化、酶活進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，①4種混交林土壤的理化、酶活均存在差異。其中降香黃檀與檀香混交林土壤的含水量、有機(jī)質(zhì)、全氮、有效鉀和脲酶含量最高，分別為：5.24%、27.5g/kg、0.85mg/g、37.46mg/kg和0.32mg/kg，降香黃檀與大果紫檀混交林土壤的pH、有效磷和多酚氧化酶含量最高，分別為：4.48、6.04mg/kg、4.19mg/kg。②通過高通量測(cè)序表明四種混交模式土壤細(xì)菌的豐富度為：降香黃檀×檀香 >降香黃檀×大果紫檀 >降香黃檀×奧氏黃檀 >降香黃檀×母生，土壤細(xì)菌多樣性為：降香黃檀×大果紫檀 >降香黃檀×奧氏黃檀 >降香黃檀×檀香 >降香黃檀×母生。其中，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門和厚壁菌門為4種混交模式中的主要菌群。③經(jīng)冗余分析和相關(guān)性分析表明，影響降香黃檀混交林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和細(xì)菌多樣性的主要土壤理化因子為：pH 值、脲酶、多酚氧化酶和有機(jī)質(zhì)。

降香黃檀；混交林；土壤細(xì)菌群落；高通量測(cè)序；多樣性

細(xì)菌作為土壤微生物中重要的組成部分，具有含氮量高，含碳量低的特點(diǎn)，對(duì)土壤養(yǎng)分的形成與分解有促進(jìn)作用。土壤細(xì)菌的微生物多樣性越高，則越有利于土壤的可持續(xù)利用和抗壓力[1-2]。但目前只有1%左右的主要細(xì)菌菌群能被檢測(cè)到[3]。采用成本低、通量高、速度快并且覆蓋深度高的第二代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)微生物的多樣性分析是十分有利的[4-5]。

高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing)又稱為新一代測(cè)序技術(shù)或第二代測(cè)序，該測(cè)序技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)而言，具有極大的優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在[6-8]：①測(cè)序通量高，可以檢測(cè)分析到樣品中的痕量微生物；②實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)化；③速度快；④準(zhǔn)確率高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更能全面的反應(yīng)環(huán)境中群落的特點(diǎn)。目前，高通量測(cè)序已廣泛的應(yīng)用于土壤微生物的研究。

降香黃檀(DalbergiaodoriferaT.Chen)是我國(guó)瀕危樹種，國(guó)家二級(jí)保護(hù)野生植物[9]，也是海南省珍貴鄉(xiāng)土樹種。降香黃檀具有藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，另外，降香黃檀落葉量大、根系發(fā)達(dá)，能改良土壤，具有很大的生態(tài)效益[10]。但歷史上人們對(duì)降香黃檀的過度砍伐利用，導(dǎo)致其資源減少，生產(chǎn)力下降。近年來，海南省雖對(duì)降香黃檀進(jìn)行了人工栽培，但在樹種的合理配置、良種選育等方面仍存在問題。目前，國(guó)外對(duì)降香黃檀的研究甚少，國(guó)內(nèi)大多集中于降香黃檀多樣性[11-12]、栽培技術(shù)[13]以及活性物質(zhì)提取[14-15]等方面的研究，針對(duì)其土壤的研究較少。已有研究表明[9]，在營(yíng)造降香黃檀人工林時(shí)，不宜發(fā)展人工純林，應(yīng)考慮與其他樹種混交，以短養(yǎng)長(zhǎng)，同時(shí)也能提高林木的抗逆性。

本研究針對(duì)海南珍貴鄉(xiāng)土樹種降香黃檀的不同混交林，應(yīng)用Miseq高通量測(cè)序的方法，結(jié)合土壤的物理化學(xué)性質(zhì)及土壤酶活性，對(duì)土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以研究降香黃檀不同混交林細(xì)菌群落的多樣性及其與環(huán)境因子的關(guān)系，為降香黃檀人工林的合理配置及健康經(jīng)營(yíng)提供參考。

1 研究區(qū)域概況

試驗(yàn)樣地位于海南省澄邁國(guó)營(yíng)林場(chǎng)(海南省澄邁縣東南部的太平鄉(xiāng))，地處19°11′ N，111°1′ E，海拔為118m，屬熱帶季風(fēng)氣候類型，年平均日照時(shí)數(shù)2059h，年平均氣溫23.8℃，相對(duì)濕度84%，年均降雨量1786.1mm，全年基本無霜。研究區(qū)面積約為2.667hm2，地貌以低丘陵和臺(tái)地為主。成土母巖主要有玄武巖和砂頁(yè)巖，成土母質(zhì)以河流沖積物發(fā)育而成的砂壤土為主，研究區(qū)的土壤主要為砂壤。

2 材料與方法

2.1 樣地設(shè)置及樣品采集

該實(shí)驗(yàn)區(qū)于2012年上旬造林。造林時(shí)，選用的降香黃檀苗木株高為(50±10)cm，奧氏黃檀為(40±10)cm，大果紫檀為(45±10)cm，檀香為(40±10)cm，母生為(30±10)cm。4個(gè)樣地的造林密度均為667株/666.7m2，行株距為1m×1m。

于2014年3月采樣，且采樣前一個(gè)月內(nèi)降雨量很少，基本處于干旱狀態(tài)。樣地的選擇是在林場(chǎng)內(nèi)選擇立地條件相似的降香黃檀不同混交模式樣地(表1)。在每個(gè)樣地內(nèi)設(shè)置5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)地，大小為10m×10m，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)地內(nèi)分別設(shè)置3個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)的土壤均是除去地表植被和枯枝落葉后采集0—20cm土層的土壤。用于測(cè)定細(xì)菌多樣性的土壤于-80℃保存?zhèn)溆?，用于理化性質(zhì)測(cè)定的土樣，作風(fēng)干過篩處理。

表1 樣地基本情況Table 1 Basic information of samples plots

Dal 0：降香黃檀×奧氏黃檀Dalbergiaodorifera×Dalbergiaoliveri；Dal 1：降香黃檀×大果紫檀Dalbergiaodorifera×Pterocarpusmacarocarpus；Dal 2：降香黃檀×檀香Dalbergiaodorifera×SantalumalbumL.；Dal 3：降香黃檀×母生Dalbergiaodorifera×HomaliumhainanenseGagnep.

2.2 研究方法

2.2.1 土壤理化性質(zhì)與酶活的測(cè)定

土壤含水量采用TZS-IW型土壤水分溫度測(cè)量?jī)x現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定；土壤pH值采用1mol/L KCl浸提用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定；土壤有機(jī)質(zhì)采用水合熱重鉻酸鉀-硫酸-比色法；土壤全氮含量測(cè)定采用半微量凱式定氮法；土壤有效磷含量采用NaHCO3浸提，全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀測(cè)定；土壤有效鉀含量測(cè)定采用火焰光度法[16]。

土壤過氧化氫酶活性的測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法(0.1mol/L高錳酸鉀mL-1)；土壤多酚氧化酶的測(cè)定采用鄰苯三酚比色法；土壤脲酶活性的測(cè)定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法[17-18]。

2.2.2 土壤總DNA的提取與測(cè)序

使用E.Z.N.A soil DNA土壤DNA提取試劑盒(OMEGA)提取土壤總DNA，以338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)為正向引物，806R(5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′)為反向引物[19]。PCR反應(yīng)體系如下，共20μL：5×FastPfu Buffe 4μL，2.5mmol/L dNTPs，2μL；Forward Primer(5μmol/L)， 0.4μL；Reverse Primer(5μmol/L),0.4μL；FastPfu Polymerase，0.4μL；Template DNA,10ng；補(bǔ)充ddH2O至20μL。PCR反應(yīng)條件為：1×(95℃，2min)；25×(95℃，30s；55℃，30s；72℃，45s；72℃，10min)；4℃ 保存。每個(gè)樣品取3μL，進(jìn)行檢測(cè)(1%瓊脂條凝膠電泳)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)將同一樣品的 PCR 產(chǎn)物混合后用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN 公司)切膠，回收 PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。之后進(jìn)行熒光定量，Miseq文庫(kù)構(gòu)建及Miseq測(cè)序。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理

Miseq測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣品后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。基于OTU聚類分析的結(jié)果，對(duì)OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析。

2.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Mothur等軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類分析和多樣性計(jì)算；通過R 軟件對(duì)初始結(jié)果進(jìn)行相對(duì)豐度制圖；利用SPSS 19進(jìn)行方差分析(Duncan)及相關(guān)性分析(Pearson)，利用Canoco for windows 4.5進(jìn)行冗余分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤理化性質(zhì)與土壤酶活性

不同樣地的土壤理化、酶活分析結(jié)果見表2，樣地的土壤類型主要屬于酸性砂壤(pH均小于4.5)，且不同混交林土壤的pH值存在極顯著性差異(P<0.001)，其中Dal 2和Dal 3的pH均值最低。不同混交林土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、有效鉀3個(gè)方面存在極顯著的差異(P<0.001)，其中Dal 2含量均最高，分別為27.59mg/g、0.85mg/kg和37.46mg/kg。4個(gè)樣地土壤的有效磷含量存在極顯著性差異(P值均小于0.001)，其中Dal 1含量最高，為6.04mg/Kg。酶活方面，過氧化氫酶和多酚氧化酶(P=0.032)存在顯著性差異(P=0.017)，脲酶存在極顯著性差異(P<0.001)。

表2 不同樣地的理化性質(zhì)及酶活的單因素方差分析Table 2 The ANOVA of physico-chemistry characteristics and enzymatic activity in different sample plots

表3 16s 有效序列的數(shù)量及分布Table 3 The number and distribution of valid sequences of 16s

3.2 土壤細(xì)菌多樣性

3.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

通過Miseq高通量測(cè)序并優(yōu)化后，4個(gè)樣地共獲得293677條序列，總堿基數(shù)為127504401bp，平均堿基長(zhǎng)度為434.17bp，其中401—500bp的堿基占總序列數(shù)的99.98%，如表3所示。

采用對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線(圖1)，從圖中可以看出，4個(gè)樣地的稀釋性曲線均趨于平坦，表明測(cè)序數(shù)據(jù)合理，更多的測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)發(fā)現(xiàn)新的OTU貢獻(xiàn)率較小。

圖1 不同樣地土壤細(xì)菌OTU稀釋曲線Fig.1 OTU rarefaction curves of soil bacteria in different plots

3.2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

在相似水平為97%的條件下，通過與Sliva數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，對(duì)序列進(jìn)行歸類分析[20-21]。結(jié)果表明，變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和厚壁菌門(Firmicutes)這5個(gè)菌門為主要菌群(圖2)所示。

對(duì)不同樣地中相對(duì)豐度超過1%的菌群進(jìn)行單因素方差分析(表4)，結(jié)果表明，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、疣微菌門、藍(lán)藻菌門和浮霉菌門在降香黃檀不同混交模式中分布比較均勻，不存在顯著性差異。而厚壁菌門(P=0.003)、擬桿菌門(P=0.026)和芽單胞菌門(P=0.019)在各樣地間存在顯著性差異， Dal 1中這3個(gè)菌門的相對(duì)豐度均高于其他3個(gè)樣地。

為了更加深入的了解降香黃檀不同混交林中土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分布及差異，去除以上的10個(gè)相對(duì)豐度超過1%的菌群后，對(duì)剩余菌群作了相對(duì)豐度分析(圖3)。單因素方差分析結(jié)果表明，裝甲菌門(Armatimonadetes)、綠菌門(Chlorobi)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和熱袍菌門(Thermotogae)在降香黃檀不同混交模式中存在差異(表5)。其中，纖維桿菌門(P=0.002)和熱袍菌門(P=0.002)在不同樣地間存在極顯著性差異，裝甲菌門(P=0.04)和迷蹤菌門(P=0.05)在不同樣地間存在顯著性差異。相較于4個(gè)樣地，纖維桿菌門在Dal 2中最多，而不存在于Dal 3中。熱袍菌門在Dal 0中最多，在其他3個(gè)樣地中無差異。裝甲菌門和迷蹤菌門在Dal 1中最少，在其他樣地中無差異。

圖2 不同樣地土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Soil bacterial community of different sample plots

3.2.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

通過對(duì)各樣地進(jìn)行多樣性的計(jì)算，并通過SPSS進(jìn)行單因素方差分析(表6)。4個(gè)樣地間，ace(P=0.013)和chao(P=0.02)指數(shù)具有顯著性差異，而shannon(P=0.133)和simpson(P=0.41)指數(shù)無顯著性差異。其中Dal 3的ace和chao指數(shù)均低于其他樣地。

表4 不同樣地細(xì)菌主要菌群相對(duì)豐度的單因素方差分析Table 4 The ANOVA of relative abundance of dominate bacteria in different sample plots

圖3 剩余菌群的群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community of rejecting relative abundance of more than 1%

表5 剩余菌群群落結(jié)構(gòu)相對(duì)豐度的方差分析Table 5 The ANOVA of rejecting relative abundance of more than 1%

表6 各樣地細(xì)菌群落的多樣性分析(相似度為97%)Table 6 Diversity index of bacterial community of different sample plots (Similarity is 97%)

3.2.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤性質(zhì)的關(guān)系

冗余分析(RDA)主要應(yīng)用于分析影響生物[22]、植被[23]、景觀分布[24]的關(guān)鍵環(huán)境因子。RDA分析能夠有效的對(duì)多個(gè)環(huán)境指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，經(jīng)過一系列的轉(zhuǎn)換、篩選，能夠有效的簡(jiǎn)化變量個(gè)數(shù)，為進(jìn)一步研究的分析創(chuàng)造條件[22]。

本次試驗(yàn)分析了土壤細(xì)菌主要菌群和非主要菌群與土壤性質(zhì)的RDA排序圖，第一軸可以解釋所有信息的52.0%，第二軸可以解釋34.1%(圖4)。經(jīng)Canoco的forward分析表明，pH 值、脲酶、多酚氧化酶和有機(jī)質(zhì)對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最為顯著，影響程度為：pH值>脲酶 >多酚氧化酶 >有機(jī)質(zhì)。從圖中可以看出，受此四種因子影響較為顯著的菌群有：迷蹤菌門、浮霉菌門、裝甲菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門、纖維桿菌門和芽單胞菌門。分析四個(gè)樣地間的歐幾里德距離，可以看出Dal 1的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其他3個(gè)樣地差異較大，Dal 0、Dal 1與Dal 3也具有較大差異，相較之下，Dal 2與Dal 3的群落結(jié)構(gòu)差異較小。

圖4 土壤菌群與土壤性質(zhì)的RDA分析Fig.4 The results from RDA to explore the relationship between bacteria and soil propertiesProteoba：變形菌門， Acidobac：酸桿菌門，Actinoba：放線菌門，F(xiàn)irmicut：厚壁菌門，Planctom：浮霉菌門，Chlorofl：綠彎菌門，Verrucom：疣微菌門，Cyanobac：藍(lán)藻菌門， Bacteroi：擬桿菌門， Gemmatim：芽單胞菌門， Armatimo：裝甲菌門， Chlamydi：衣原體門， Elusimic：迷蹤菌門， Fibrobac：纖維桿菌門， Nitrospi：硝化螺旋菌門， Thermoto：熱袍菌門， Chlorobi：綠菌門，Candidat：候選門， OM：有機(jī)質(zhì)，MC：含水量， TN：全氮， AP：有效磷， AK：有效鉀， PPO：多酚氧化酶

3.2.5 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性分析及其與土壤理化的相關(guān)性

經(jīng)過SPSS分析計(jì)算樣地土壤性質(zhì)與細(xì)菌多樣性指數(shù)的相關(guān)性(表7)，結(jié)果表明過氧化氫酶與細(xì)菌多樣性指數(shù)無顯著相關(guān)；有效磷與ace指數(shù)、chao指數(shù)呈顯著正相關(guān)； pH值、有效磷、多酚氧化酶與shannon指數(shù)呈顯著正相關(guān)，與simpson指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)；有機(jī)質(zhì)、全氮、有效鉀、脲酶與shannon指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，與simpson指數(shù)呈顯著正相關(guān)。其中，pH值、有機(jī)質(zhì)、脲酶和多酚氧化酶與shannon指數(shù)和simpson指數(shù)的相關(guān)性為極顯著，說明土壤細(xì)菌的多樣性主要受該4個(gè)指標(biāo)的影響。

表7 土壤理化、酶活與細(xì)菌多樣性的相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis among physico-chemistry characteristics, enzymatic activity and bacteria

4 討論

混交林不僅對(duì)林地的溫度、水分有所改善，而且增添了更為豐富的植物枯落物，從而增加了土壤的營(yíng)養(yǎng)物，提高土壤通透性，增強(qiáng)保水能力，并且能夠增加土壤微生物的數(shù)量和土壤酶活，到達(dá)提高林地土壤肥力的效果[25]。

本課題組之前使用傳統(tǒng)的方法研究了降香黃檀混交林土壤微生物的分布、數(shù)量，已證明降香黃檀混交林的土壤微生物多樣性優(yōu)于純林。本次試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)樣地的實(shí)際情況，選擇立地條件基本一致的降香黃檀混交林進(jìn)行研究。

4.1 土壤理化性質(zhì)

4種混交林土壤的含水量偏低，這主要是由于所選樣地的土壤屬于砂壤，保水能力差，且采樣前半個(gè)月處于干旱狀態(tài)，造成了土壤含水量總體偏低，4個(gè)樣地在含水量上無顯著性差異。

土壤pH值是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素之一，pH值的變化對(duì)土壤的有機(jī)質(zhì)分解與合成，N、P、K營(yíng)養(yǎng)元素的合成與轉(zhuǎn)化有著重要的作用[26]。在此次四種混交模式中， Dal 1的pH值最高，其次是Dal 0，而Dal 2和Dal 3在pH值方面無顯著性差異。

有機(jī)質(zhì)含量與土壤肥力存在著密切的關(guān)系，有機(jī)質(zhì)為植物提供了一定有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)可改變土壤的物理性質(zhì)，促進(jìn)土壤微生物的活動(dòng)[27]。本研究中，可能由于與混交林不同樹種的生長(zhǎng)習(xí)性、落葉和分泌物不同，造成了土壤有機(jī)質(zhì)含量的差別。相關(guān)性分析表明，有機(jī)質(zhì)與土壤含水量存在顯著的正相關(guān)，這可能是由于土壤有機(jī)質(zhì)自身能夠吸收、保持一定的水分，當(dāng)有機(jī)質(zhì)含量增多時(shí)，土壤中有機(jī)膠體的含量也增多[28]，另一方面有機(jī)質(zhì)多的土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)多，并且含有大量的毛管孔隙，可吸收并保持水分，從而導(dǎo)致土壤的含水量增多。但總體來看，四個(gè)樣地的有機(jī)質(zhì)含量也偏低，這也與土壤類型有很大的關(guān)系。

土壤中的全氮、有效磷、有效鉀是衡量土壤氮素、磷素和鉀素供應(yīng)狀況的重要指標(biāo)，在此次試驗(yàn)中，四種混交模式的全氮、有效鉀的變化趨勢(shì)與有機(jī)質(zhì)變化趨勢(shì)相同，與有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)。這可能與氮元素和鉀元素在土壤中存在的形式有關(guān)系。

在土壤酶活性方面，過氧化氫酶能在一定程度上反應(yīng)出土壤微生物的強(qiáng)度[29]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在四個(gè)混交模式中，土壤微生物強(qiáng)度無顯著性差異。脲酶能促進(jìn)土壤中有機(jī)質(zhì)分子的水解，而多酚氧化酶則是促進(jìn)土壤中的芳香族化合物轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)[25]，因而研究結(jié)果與理論相符，脲酶與多酚氧化酶呈極顯著的負(fù)相關(guān)，有機(jī)質(zhì)與脲酶呈極顯著正相關(guān)，與多酚氧化酶呈極顯著負(fù)相關(guān)，與熊漢鋒[30]，田昆[31]和Beri[32]的研究結(jié)果相一致。

4.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

在本研究中發(fā)現(xiàn)，四種降香黃檀混交林共存在18個(gè)細(xì)菌門的分類。其中，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門和厚壁菌門為四種混交模式中的主要菌群，而綠菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、纖維桿菌門、熱袍菌門、裝甲菌門和迷蹤菌門9個(gè)菌門在4種混交模式中的相對(duì)豐度存在顯著性差異，這可能是由于不同樹種的生長(zhǎng)代謝及根系分泌物不同，引起了土壤理化性質(zhì)的發(fā)生不同程度的改變，導(dǎo)致了菌群的差異。

多樣性分析ace指數(shù)表明細(xì)菌群落的OTU數(shù)目的種類為：Dal 2>Dal 1>Dal 0>Dal 3；chao指數(shù)表明各樣地細(xì)菌的物種總數(shù)為：Dal 2>Dal 1>Dal 0>Dal 3。結(jié)合土壤理化性質(zhì)分析，Dal 2在有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷、有效鉀方面含量均最高，說明了降香黃檀與檀香混交，能夠提高土壤的肥力，豐富土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。反之，降香黃檀與母生混交土壤的理化、酶活均最低，且OTU數(shù)目和細(xì)菌物種總數(shù)也最低。

4.3 土壤細(xì)菌多樣性及其與土壤性質(zhì)的關(guān)系

根據(jù)shannon指數(shù)和simpson指數(shù)，可以看出各樣地細(xì)菌群落的多樣性為：Dal 1>Dal 0>Dal 2>Dal 3。也就是說，雖然Dal 2的細(xì)菌物種總數(shù)多，但是多樣性卻不如Dal 1，Dal 0?？赡苁且?yàn)榕c降香黃檀混交樹種中，Dal 1中的大果紫檀和Dal 0中的奧氏黃檀屬于豆科，樹種本身具有固氮能力，可以為更多種類的微生物提供更好的生長(zhǎng)環(huán)境。而Dal 2中的檀香，其自身不能健康生長(zhǎng)，需依靠根上的吸盤從假蒿、山毛豆、降香黃檀處吸取營(yíng)養(yǎng)和水分，雖然有豆科植物山毛豆作為伴生樹，但絕大部分營(yíng)養(yǎng)成分供檀香生長(zhǎng)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，這3個(gè)樣地的多樣性都優(yōu)于Dal 3，這也說明了固氮植物能夠提高土壤細(xì)菌的多樣性。

通過分析理化性質(zhì)與細(xì)菌多樣性系數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果表明與土壤細(xì)菌多樣性shannon指數(shù)和simpson指數(shù)有極顯著相關(guān)的理化性質(zhì)為pH值、有機(jī)質(zhì)，酶活為脲酶和多酚氧化酶，與之前的研究結(jié)果一致[33]，也有研究表明，在門的分類水平上，pH值、有機(jī)質(zhì)能強(qiáng)烈的影響微生物菌群[8,34]。說明土壤pH值影響著土壤菌群群落的代謝活動(dòng)，從而引起土壤有機(jī)質(zhì)和酶活的變化，而這些變化又進(jìn)一步影響土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

4.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與降香黃檀混交林

4種降香黃檀混交林中，降香黃檀×大果紫檀、降香黃檀×檀香、降香黃檀×奧氏黃檀對(duì)土壤的改良效果較好，而降香黃檀×母生效果最差。

從冗余分析中可知，厚壁菌門、纖維桿菌門和硝化螺旋菌門與pH呈正相關(guān)，說明此3類菌門的生長(zhǎng)代謝能夠影響土壤的pH。4個(gè)樣地中，降香黃檀×大果紫檀混交林土壤的pH值最高，此3種菌群的相對(duì)豐度也最高，表明降香黃檀×大果紫檀能夠改善土壤酸化狀況。

迷蹤菌門與土壤脲酶、全氮、有機(jī)質(zhì)也呈正相關(guān)，表明該菌門在有機(jī)質(zhì)、氮素等的轉(zhuǎn)化過程中扮演了重要角色，且降香黃檀×檀香土壤中的有機(jī)質(zhì)、全氮、有效鉀和脲酶含量最高，說明降香黃檀×檀香能夠改善土壤貧瘠的狀況，提高土壤肥力。

綠彎菌門、熱袍菌門與含水量、過氧化氫酶呈正相關(guān)，且此兩種菌門在降香黃檀×奧氏黃檀混交模式中相對(duì)豐度最高，說明降香黃檀×奧氏黃檀能夠提高土壤的蓄水能力，降低過氧化物對(duì)生物體造成的傷害。

5 結(jié)論

(1)降香黃檀不同混交模式土壤理化性質(zhì)、酶活均存在不同程度的差異。其中降香黃檀與檀香混交林土壤的含水量、有機(jī)質(zhì)、全氮、有效鉀、脲酶高于其他樣地。降香黃檀與大果紫檀混交林土壤的pH值、有效磷、多酚氧化酶高于其他樣地。

(2)高通量測(cè)序技術(shù)的結(jié)果表明，4種不同模式降香黃檀混交林的土壤細(xì)菌的豐富度為：降香黃檀×檀香 >降香黃檀×大果紫檀 >降香黃檀×奧氏黃檀 >降香黃檀×母生；各樣地的土壤細(xì)菌多樣性為：降香黃檀×大果紫檀 >降香黃檀×奧氏黃檀 >降香黃檀×檀香 >降香黃檀×母生。

(3)4種降香黃檀混交林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分布及多樣性主要受pH值、有機(jī)質(zhì)、脲酶和多酚氧化酶的影響。

[1] Kaschuk G, Alberton O, Hungria M.Quantifying effects of different agricultural land uses on soil microbial biomass and activity in Brazilian biomes: inferences to improve soil quality.Plant and Soil, 2011, 338(1/2): 467-481.

[2] Zhou J Z, Xia B C, Treves D S, Wu L Y, Marsh T L, O′Neill R V, Palumbo A V, Tiedje J M.Spatial and resource factors influencing high microbial diversity in soil.Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(1): 326-334.

[3] Fromin N, Hamelin J, Tarnawski S, Roesti D, Jourdain-Miserez K, Forestier N, Teyssier-Cuvelle S, Gillet F, Aragno M, Rossi P.Statistical analysis of denaturing gel electrophoresis (DGE) finger printing patterns.Environment Microbiology, 2002, 4(11): 634-643.

[4] Prakash T, Taylor T D.Functional assignment of metagenomic data: challenges and applications.Briefings in Bioinformatics, 2012, 13(6): 711-727.

[5] Jiang B, Liang X J, Chen Y, Ma T, Liu L Y, Li J F, Jiang R, Chen T, Zhang X G, Li S.Integrating next-generation sequencing and traditional tongue diagnosis to determine tongue coating microbiome.Scientific Reports, 2012, 2: 936-936.

[6] 秦楠, 栗東芳, 楊瑞馥.高通量測(cè)序技術(shù)及其在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用.微生物學(xué)報(bào), 2011, 51(4): 445-457.

[7] 張彩霞.新一代高通量測(cè)序技術(shù)研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境條件的響應(yīng)[D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[8] Fierer N, Jackson R B.The diversity and biogeography of soil bacterial communities.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(3): 626-631.

[9] 邱治軍, 周光益, 陳升華.海南特有珍貴紅木樹種——降香黃檀.林業(yè)實(shí)用技術(shù), 2004, (6): 41-42.

[10] 梁建平.廣西珍稀瀕危樹種.南寧: 廣西科學(xué)技術(shù)出版社, 2001: 224-225.

[11] 余敏.降香黃檀與多裂黃檀木材DNA提取及其rDNA-ITS序列分析[D].合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[12] 楊新全, 馮錦東, 魏建和, 李榕濤, 何明軍, 楊成民.我國(guó)特有瀕危藥用植物降香黃檀遺傳多樣性研究.世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2007, 9(2): 73-76.

[13] 伍慶均.降香黃檀培育技術(shù).廣東林業(yè)科技, 2014, 30(1): 74-77.

[14] 黃星.降香黃檀籽黃酮的提取分離及生理活性研究[D].無錫: 江南大學(xué), 2012.

[15] Zhao X B, Mei W L, Gong M G, Zuo W J, Bai H G, Dai H F.Antibacterial activity of the flavonoids from dalbergia odorifera on ralstonia solanacearum.Molecules, 2011, 16(12): 9775-9782.

[16] 劉鴻雁, 黃建國(guó).縉云山森林群落次生演替中土壤理化性質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2005, 16(11): 2041-2046.

[17] 劉善江, 夏雪, 陳桂梅, 卯丹, 車升國(guó), 李亞星.土壤酶的研究進(jìn)展.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 27(21): 1-7.

[18] 毛志剛, 谷孝鴻, 劉金娥, 任麗娟, 王國(guó)祥.鹽城海濱濕地鹽沼植被及農(nóng)作物下土壤酶活性特征.生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 30(18): 5043-5049.

[19] Pereira L B, Vicentini R, Ottoboni L M M.Changes in the bacterial community of soil from a neutral mine drainage channel.Plos One, 2014, 9(5): e96605.

[20] 王圣潔, 劉君昂, 何苑皞, 周國(guó)英, 譚益民, 周潔塵.基于焦磷酸測(cè)序的杉木人工林微型土壤動(dòng)物多樣性.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 25(6): 1661-1668.

[21] 何苑皞, 周國(guó)英, 王圣潔, 李河.杉木人工林土壤真菌遺傳多樣性.生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 34(10): 2725-2736.

[22] Nobes K, Uthicke S, Henderson R.Is light the limiting factor for the distribution of benthic symbiont bearing foraminifera on the Great Barrier Reef?.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2008, 363(1/2): 48-57.

[23] Hietel E, Waldhardt R, Otte A.Statistical modeling of land-cover changes based on key socio-economic indicators.Ecological Economics, 2007, 62(3/4): 496-507.

[24] Benjamin K, Bouchard A, Domon G.Abandoned farmlands as components of rural landscapes: An analysis of perceptions and representations.Landscape and Urban Planning, 2007, 83(4): 228-244.

[25] 林先貴.土壤微生物研究原理與方法.北京: 高等教育出版社, 2010: 243-262.

[26] Ndour N T B, Achouak W, Christen R, Heulin T, Brauman A, Chotte J L.Characteristics of microbial habitats in a tropical soil subject to different fallow management.Applied Soil Ecology, 2008, 38(1): 51-61.

[27] 李志洪, 趙蘭坡, 竇森.土壤學(xué).北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008: 80-85.

[28] 艾海艦.土壤持水性及孔性的影響因素淺析.干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究, 2002, 20(3): 75-79.

[29] 戴萬宏, 黃耀, 武麗, 俞佳.中國(guó)地帶性土壤有機(jī)質(zhì)含量與酸堿度的關(guān)系.土壤學(xué)報(bào), 2009, 46(5): 851-860.

[30] 熊漢鋒, 黃世寬, 陳治平, 廖勤周, 譚啟玲.梁子湖濕地土壤酶初步研究.生態(tài)環(huán)境, 2006, 15(6): 1305-1309.

[31] 田昆, 陸梅, 常鳳來, 莫?jiǎng)︿h, 黎良才, 楊永興.云南納帕海巖溶濕地生態(tài)環(huán)境變化及驅(qū)動(dòng)機(jī)制.湖泊科學(xué), 2004, 16(1): 35-42.

[32] Beri V, Brar S S.Urease activity in subtropical, alkaline soils of India.Soil Science, 1978, 126(6): 330-335.

[33] 張薇, 魏海雷, 高洪文, 胡躍高.土壤微生物多樣性及其環(huán)境影響因子研究進(jìn)展.生態(tài)學(xué)雜志, 2005, 24(1): 48-52.

[34] Chu H, Fierer N, Lauber C L, Caporaso J G, Knight R, Grogan P.Soil bacterial diversity in the Arctic is not fundamentally different from that found in other biomes.Environmental Microbiology, 2010, 12(11): 2998-3006.

Differential analysis of soil bacteria diversity in different mixed forests ofDalbergiaodorifera

YANG Jing, ZHOU Guoying*, TIAN Yuanyuan, LIU Qianli, LIU Chengfeng, YANG Quan, ZHOU Jiechen

MinistryofEducationKeyLaboratoryofCultivationandProtectionforNon-WoodForestTrees,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha410004,China

DalbergiaodoriferaT.Chen is one of China′s endangered species.It is also an endemic species that mainly distributes in Hainan, Guangdong, Fujian, etc.Dalbergiaodoriferahas great values in medicine, economics and ecology, and its medicinal properties are specified in the Chinese Pharmacopoeia.But the resource was reduced and the productivity was declined due to years of deforestation.Developing mixed forests ofDalbergiaodoriferahas been becoming a major trend of Chengmai farm in Hainan Province, because mixed forests can not only adjust the temperature and relative humidity of woodland, but also improve soil fertility.Soil can provide nutrition for aboveground vegetations, as well as soil microorganisms.Soil bacteria, as one of the key members of soil microorganisms, plays an important role in promoting organic matter decomposition, accelerating mineral nutrition cycle, maintaining and improving soil fertility.People can understand the soil status better by analyzing the relationship between soil bacterial community and soil characteristics, and finally develop a method to improve theDalbergiaodoriferaplantation.However, only about 1% bacteria could be assayed by traditional methods.High-throughput sequencing is a new method that can get the classification information of soil bacteria more conveniently and accurately, and avoid the limitations of traditional methods.This method has been widely used in studying soil microorganisms.We investigated soil bacteria diversity in four different mixed forests ofDalbergiaodoriferaplantation, i.e.Dalbergiaodoriferamixed withDalbergiaoliveri,Pterocarpusmacarocarpus,SantalumalbumL.andHomaliumhainanenseGagnep., respectively, in Chengmai County, Hainan Province in China.A high-throughput sequencing technique was used to analyze the relationship and differences among these four plots to find a way that could improve soil fertility ofDalbergiaodoriferaplantation.After analyses, the results showed that soil physical-chemical characteristics and soil enzyme activities were different in the four mixed forest, i.e.theDalbergiaodoriferaandSantalumalbumL.mixed forests with higher moisture content, organic matter, total N, available K and Ureas;DalbergiaodoriferaandPterocarpusmacarocarpusmixed forests with higher pH, available P and polyphenol oxidase.The results of high-throughput sequencing showed that soil bacterial abundances of these four plantations were:Dalbergiaodorifera×SantalumalbumL.>Dalbergiaodorifera×Pterocarpusmacarocarpus>Dalbergiaodorifera×Dalbergiaoliveri>Dalbergiaodorifera×HomaliumhainanenseGagnep., and the soil bacteria diversity of these four mixed models were:Dalbergiaodorifera×Pterocarpusmacarocarpus>Dalbergiaodorifera×Dalbergiaoliveri>Dalbergiaodorifera×SantalumalbumL.>Dalbergiaodorifera×HomaliumhainanenseGagnep..The dominant bacteria taxa in the four mixed forests were Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi and Firmicutes.The results of redundancy analysis and correlation analysis showed that pH, Ureas, polyphenol oxidase and organic matter were the main factors that had significant effect on the structure and diversity of soil bacterial community in this four mixed forests.Our analysis of bacteria 16S rRNA-based dataset showed differences in soil bacterial community structure among four mixed forests ofDalbergiaodorifera.But further research is also needed to get more information in soil microorganisms.

Dalbergiaodorifera;mixed forests;soil bacteria community;high-throughput sequencing;diversity

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201304402)

2014-09-19; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期:

日期:2015-05-21

10.5846/stxb201409191856

*通訊作者Corresponding author.E-mail: gyzhou2118@163.com

楊菁,周國(guó)英,田媛媛,劉倩麗,劉成鋒,楊權(quán),周潔塵.降香黃檀不同混交林土壤細(xì)菌多樣性差異分析.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(24):8117-8127.

Yang J, Zhou G Y, Tian Y Y, Liu Q L, Liu C F, Yang Q, Zhou J C.Differential analysis of soil bacteria diversity in different mixed forests ofDalbergiaodorifera.Acta Ecologica Sinica,2015,35(24):8117-8127.