木霉葡聚糖酶及其編碼基因研究進(jìn)展

曲曉華，譚 飛，馬 杰

（1.威海市園林管理局，山東 威海 264200；2.山東高速路橋養(yǎng)護(hù)有限公司，山東 濟(jì)南 250014；3.威海市環(huán)境保護(hù)局，山東 威海 264200）

木霉屬真菌屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目的粘孢菌類。葡聚糖酶廣泛存在于動(dòng)植物、藻類、細(xì)菌和真菌體內(nèi)，是木霉防治真菌性病害的主要機(jī)制之一，在生物防治過(guò)程中有降解真菌細(xì)胞壁的活性因而被經(jīng)常研究。

1 葡聚糖酶的組成、來(lái)源及酶學(xué)性質(zhì)

葡聚糖是由D－葡萄糖以α和（或）β兩種構(gòu)象形式連接構(gòu)成的一類均聚物。有些葡聚糖分子是由葡萄糖殘基以簡(jiǎn)單的線性形式連接而成，而另外一些則是由線性和帶支鏈等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的形式存在［1－2］。

α－葡聚糖和β－葡聚糖廣泛存在于自然界中。葡聚糖酶降解的多聚體在自然界中以纖維素和半纖維素大量存在，作為胞內(nèi)多糖儲(chǔ)備形式的糖原是一種α－1，4葡聚糖，它廣泛存在于除了卵菌以外的真菌中。在卵菌中，胞內(nèi)多糖是以β－1，3－葡聚糖儲(chǔ)備的。另外，葡聚糖還參與真菌細(xì)胞壁的組成和胞外多糖的形成［3－4］。葡聚糖裂解酶廣泛存在于高等植物、細(xì)菌、真菌和依靠它們生存的各種各樣的寄主中。在高等植物中，葡聚糖裂解酶被認(rèn)為是植物抵御病原真菌的防御系統(tǒng)之一［5］。目前已報(bào)道的β－葡聚糖酶的不同功能包括：細(xì)胞壁中葡聚糖的轉(zhuǎn)移和饑餓狀態(tài)下儲(chǔ)存糖原；降解植物病原體的胼胝質(zhì)［6］；腐生生物的營(yíng)養(yǎng)；真菌寄生物的致病機(jī)理和營(yíng)養(yǎng)等［7］。參與細(xì)胞內(nèi)或胞壁骨架處器官形成的葡聚糖酶通常具有高Km值、并且表現(xiàn)出組成型形成或發(fā)育調(diào)控的特點(diǎn)。代謝水解酶更傾向于分泌到胞外，具有較低的Km值，它們一般受到營(yíng)養(yǎng)參數(shù)的調(diào)控，通常不會(huì)在菌絲中累積［8－9］。

2 葡聚糖酶的純化和性質(zhì)

2.1 β－葡聚糖酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)

大部分人采用色譜分析技術(shù)來(lái)提純?chǔ)拢暇厶敲浮ubordieu等［10－11］在1985年從哈茨木霉的商品酶制劑中分離到2個(gè)外切β－1，3－葡聚糖酶、1個(gè)內(nèi)切β－1，6－葡聚糖酶和1個(gè)β－葡聚糖酶單體。這兩個(gè)外切β－1，3－葡聚糖酶中，一個(gè)酶的活性中心主要是由分子量大小為40kDa的蛋白構(gòu)成的，此酶能降解灰霉病菌的β－1，3葡聚糖和β－1，6葡聚糖。β葡聚糖酶是由兩個(gè)外切β－1，3－葡聚糖酶和一個(gè)內(nèi)切β－1，3－葡聚糖酶組成的，它們的等電點(diǎn)pI分別為5.25、4.95和4.20。Bielecki等［12］從鉤狀木霉的另一個(gè)商品化制劑（名叫“Onozuka”）中分離純化出2個(gè)β－1，3－葡聚糖酶：一個(gè)是酸性但沒有裂解細(xì)胞壁活性的水解海帶多糖（β－1，3葡聚糖）的酶，另一個(gè)對(duì)釀酒酵母有細(xì)胞壁裂解活性。Devries等［13］1973年從一株寄生在真菌中的鉤狀木霉里分離純化出一種外切β－1，3－葡聚糖酶。Tangarone等［14］（1989年）在含有D－葡萄糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)長(zhǎng)枝木霉，得到了一種昆布多糖酶，該酶僅僅催化β－1，3糖苷鍵的水解，其最適pH和溫度分別為4.8和55℃，分子量為70kDa，HgCl2、MnCl2、KMnO4和N－溴代琥珀酰亞胺可顯著抑制酶的活性。

近年來(lái)研究最多的是哈茨木霉CECT2413在寄生其他真菌過(guò)程中產(chǎn)生的β－葡聚糖酶。大部分研究都是采用等電法從哈茨木霉中分離出1種堿性同工酶和至少3種酸性同工酶。通常說(shuō)的β－1，3－葡聚糖酶BGN13.1是以石耳多糖為介質(zhì)采用吸附法純化到的純物質(zhì)。BGN13.1的分子量是78kDa且不能被糖基化。這種酶在以釀酒酵母細(xì)胞壁和海帶多糖為底物時(shí)表現(xiàn)出最大的酶活性（對(duì)海帶多糖的Km值是3.3mg／mL）。這個(gè)酶屬于內(nèi)切β－1，3－葡聚糖酶。BGN13.1是木霉特有的酶，因?yàn)槊庖邔W(xué)反應(yīng)表明：這個(gè)酶的抗血清與從真菌和植物中提取的β葡聚糖酶沒有發(fā)生交叉反應(yīng)。同樣的這個(gè)酶與從哈茨木酶中提取的β－1，3－葡聚糖酶也不發(fā)生抗血清反應(yīng)。哈茨木霉CECT2413至少產(chǎn)生2種的內(nèi)切β－1，6－葡聚糖酶，純化后發(fā)現(xiàn)分子量大小為51kDa和43kDa。這個(gè)43kDa的β－1，6－葡聚糖酶具有β－1，6連接，有內(nèi)切活性沒有糖苷鍵的鏈接［15］。將一些木霉（綠色木霉、長(zhǎng)枝木霉、瑞氏木霉、康寧木霉、綠木霉）的培養(yǎng)物采用Western雜交進(jìn)行檢測(cè)，雜交結(jié)果表明這些木霉在相同條件下都產(chǎn)生BGN16.2。

2.2 α－葡聚糖酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)

大部分的真菌菌絲細(xì)胞壁都含有一種堿溶性的α－1，3－葡聚糖，這對(duì)于細(xì)胞壁的成分和骨架構(gòu)成的穩(wěn)定性很重要。所謂堿溶性葡聚糖的成分較復(fù)雜，可以是近似純的由α－糖苷鍵連接的多糖，也可以是由α－1，4糖苷鍵有規(guī)則地交替連接而成的聚合物。有報(bào)道在裂褶菌細(xì)胞壁上生長(zhǎng)的綠色木霉菌株BS754.33產(chǎn)生的一個(gè)內(nèi)切α－1，3－葡聚糖酶的純化，這個(gè)酶是在低pH值、低離子強(qiáng)度下用CM－纖維素柱層析純化得到的［13］。水解來(lái)自黑曲霉的擬黑曲多糖（Pseudonigeran，一種α－1，3葡聚糖）時(shí)僅僅釋放出葡萄糖；但沒有對(duì)這個(gè)酶水解黑曲霉多糖（Nigeran，為α－1，3－葡聚糖和α－1，4－葡聚糖的混合物）及水解淀粉活性的檢測(cè)。Tsunoda等［16］描述了從來(lái)自綠色木霉的商品化纖維素酶制劑中純化出了一個(gè)外切α－1，3－葡聚糖酶，這個(gè)外切α－1，3－葡聚糖酶的分子量為47kDa，最適pH值為4.5，Km值為7.1。李氏木霉在擬黑曲多糖培養(yǎng)基上至少能夠產(chǎn)生一種分子量為47kDa的胞外內(nèi)切α－1，3－葡聚糖酶，該酶的 Km值為10－2mol／L，對(duì)于一種與碳營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的酶來(lái)說(shuō)，這個(gè)Km值就顯得非常高了［17］，葡萄糖能抑制這個(gè)內(nèi)切α－1，3－葡聚糖酶的形成。

1993年，Quivey等［18］也報(bào)道了從哈茨木霉菌株OMZ779里分離到一個(gè)大小為15kDa的內(nèi)切α－1，3－葡聚糖酶。2001年，Ait－Lahsen研究了哈茨木霉菌菌株CECT2413的α－1，3－葡聚糖酶，發(fā)現(xiàn)該菌株在以多糖、真菌細(xì)胞壁或者蒸汽滅菌的菌絲為碳源時(shí)，可以分泌α－1，3－葡聚糖酶，其中的一個(gè)酶即AGN1311被分離純化為單體酶，等電點(diǎn)偏堿性，該酶為外切的α－1，3－葡聚糖酶，可以裂解植物病原真菌的細(xì)胞壁從而抑制病原菌生長(zhǎng)，Northern和Western分析表明，該酶可被模擬的拮抗條件所誘導(dǎo)產(chǎn)生。

3 葡聚糖酶編碼基因、合成調(diào)控和功能

3.1 β－葡聚糖酶的編碼基因

從哈茨木霉CECT2413中克隆到2個(gè)葡聚糖酶基因；一個(gè)是內(nèi)切β－1，3－葡聚糖酶編碼基因，基因編碼的蛋白質(zhì)大小為78kDa；另一個(gè)是內(nèi)切β－1，6葡聚糖酶編碼基因，基因編碼的蛋白質(zhì)大小為43kDa［19］。哈茨木霉基因所編碼的成熟酶蛋白由728個(gè)氨基酸組成，該蛋白序列很可能是被一個(gè)Kex2加工肽酶所切割，然后終止于KR［20］。來(lái)源于細(xì)菌、酵母、絲狀真菌和植物的bgn13.1線性序列的保守區(qū)域不同于其他來(lái)源的bgn13.1［21］。從一些文獻(xiàn)中也可以看出由bgn13.1形成的外群體和其他的β－葡聚糖酶編碼基因［22］或β－1，6葡聚糖酶編碼基因［12］在親緣關(guān)系上比較遠(yuǎn)。但是由bgn13.1形成的外群體和木霉纖維素酶的親緣關(guān)系比較近。

哈茨木霉CECT2413的胰蛋白酶純化后，根據(jù)其氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物克隆了β－1，6－葡聚糖酶的編碼基因［23］，與白色念珠菌來(lái)源的外切β－1，3－葡聚糖酶也有部分同源性。Rachel等［24］人研究了T.harzianum菌株 T－Y的β－1，3－葡聚糖酶分子生物學(xué)特性，并得到了它的基因序列。Su等［25］克隆了T.vriens的bgn1和bgn2基因，提取了該菌株的mRNA，構(gòu)建了cDNA文庫(kù)，以擴(kuò)增得到的2條基因片段為探針，釣取了β－1，3－葡聚糖酶的全基因序列。高雯［26］等在哈茨木霉LTR－2中克隆出了內(nèi)切β－1，3－葡聚糖酶基因glu，該序列已經(jīng)提交GenBank，登錄號(hào)為EF176582。

3.2 β－葡聚糖酶的合成調(diào)控和功能

和其他的一些絲狀真菌一樣，木霉和粘帚霉［27］也是通過(guò)底物誘導(dǎo)和代謝產(chǎn)物阻遏來(lái)調(diào)控β－葡聚糖酶的產(chǎn)生。像β－1，3葡聚糖這樣的大分子是如何誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生、催化自身分解的，答案仍然未知。通過(guò)與纖維素酶系統(tǒng)的類比，認(rèn)為生物化學(xué)與分子生物學(xué)途徑與一種模型相一致，在這種模型中，附著在分生孢子上的外切葡聚糖酶首先攻擊了β－1，3葡聚糖分子［28］。釋放出的二糖被菌絲體吸收，促進(jìn)葡聚糖酶進(jìn)一步的生物合成。生長(zhǎng)在不同碳源中的綠木霉或生長(zhǎng)在寄主細(xì)胞壁中的粘綠木霉，它們的培養(yǎng)基上清液中都有β葡聚糖酶活性、幾丁質(zhì)酶活性、脂肪酶活性和蛋白酶活性。幾丁質(zhì)也能誘導(dǎo)長(zhǎng)枝木霉和玉米圓斑病產(chǎn)生β－1，3－葡聚糖酶［29］。

在自然情況下幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的底物大多數(shù)情況下同時(shí)存在（真菌細(xì)胞壁），因此木霉的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶一般被同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生，而僅僅為單一底物所誘導(dǎo)的情況并不多見［30］。酶對(duì)底物的相對(duì)活性是多種多樣的，但是木霉β－葡聚糖酶的最高活性出現(xiàn)在其以寄主細(xì)胞壁作為基質(zhì)生長(zhǎng)的時(shí)候。用培養(yǎng)了8天以后的樣品做SDS－PAGE電泳分析，結(jié)果表明胞外酶蛋白的出現(xiàn)明顯受底物誘導(dǎo)和產(chǎn)物阻遏機(jī)制的影響，蛋白的失活、降解和所檢測(cè)到的酶活性都是在不同的作用時(shí)間誘導(dǎo)的結(jié)果［31］。在另外一些真菌中，酶的失活是新蛋白合成、蛋白被部分酶解和糖組分消除造成的結(jié)果［32］。有人認(rèn)為，不同真菌的細(xì)胞壁對(duì)水解酶的選擇性誘導(dǎo)和木霉的重復(fù)寄生能力相關(guān)［33］。然而Ridout等［34］發(fā)現(xiàn)，木霉在以離體細(xì)胞壁為基質(zhì)生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生的水解酶蛋白譜，不同于它直接拮抗植物病原真菌時(shí)產(chǎn)生的水解酶蛋白譜。

一些重要的β－葡聚糖酶被研究的很詳細(xì)。Dela Cruz等發(fā)現(xiàn)哈茨木霉CECT2413在不同的碳源培養(yǎng)基上被幾丁質(zhì)、黑曲霉多糖（α－1，3和α－1，4葡聚糖）、石耳多糖（β－1，6葡聚糖）、真菌細(xì)胞壁、葡萄糖脅迫等條件誘導(dǎo)以后能產(chǎn)生外切β－1，3－葡聚糖酶和外切β－1，6－葡聚糖酶。但酶的產(chǎn)生被葡萄糖所抑制。無(wú)論是干擾RNA合成還是干擾蛋白質(zhì)合成的化合物，都能夠抑制對(duì)酶的誘導(dǎo)，表明在酶的合成過(guò)程中存在翻譯前的調(diào)控機(jī)制，這種調(diào)控機(jī)制在很多其他菌株中（長(zhǎng)枝木霉、綠色木霉、康寧木霉、李氏木霉和粘綠木霉）也觀察到了相似的情形。在大多數(shù)情況下，當(dāng)有2%葡萄糖存在的條件下一般都能觀察到β－葡聚糖酶的基底活性。然而，當(dāng)不同的β－葡聚糖酶同工酶被單獨(dú)研究的時(shí)候就發(fā)現(xiàn)了一種不同的調(diào)控模式［27］。在幾丁質(zhì)、海帶多糖、石耳多糖存在的條件下檢測(cè)到4個(gè)同工酶，但在真菌細(xì)胞壁為基質(zhì)生長(zhǎng)時(shí)，只有基礎(chǔ)性的內(nèi)切β－1，3葡聚糖酶可以合成。BGN13.1的轉(zhuǎn)錄則不為葡萄糖所抑制，它的產(chǎn)物是基礎(chǔ)性的內(nèi)切β－1，3葡聚糖酶，在有2%葡萄糖存在的條件下生長(zhǎng)，能檢測(cè)到它的BGN13.1活性。當(dāng)在真菌細(xì)胞壁中生長(zhǎng)時(shí)，雖然這個(gè)內(nèi)切β－1，3葡聚糖酶單獨(dú)存在時(shí)不能在含有真菌細(xì)胞壁的培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明水解圈，但是與其他水解酶配合，能夠抑制植物病原菌。因?yàn)檫@個(gè)內(nèi)切β－1，3葡聚糖酶的特異性誘導(dǎo)和裂解活性，被認(rèn)為是木霉對(duì)其他真菌的拮抗酶，當(dāng)然該酶在木霉的腐生生活中的意義也沒有被忽略［35］。

哈茨木霉CECT2413的內(nèi)切β－1，6－葡聚糖酶編碼基因（bgn16.2）的表達(dá)也被葡萄糖所抑制，而為細(xì)胞壁中的聚合物所誘導(dǎo)，這個(gè)基因的cDNA是從80000個(gè)克隆中獲得的唯一一個(gè)拷貝，其mRNA水平也很低，說(shuō)明該基因的表達(dá)很微弱。將木霉放在酵母細(xì)胞壁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以產(chǎn)生內(nèi)切β－1，6－葡聚糖II，并產(chǎn)生透明的水解圈，酶的濃度較高時(shí)與其他水解酶協(xié)同作用，可以抑制其他真菌的生長(zhǎng)，例如當(dāng)濃度為25mg／mL時(shí)，抑制率為70%～80%［27］。真菌的β－葡聚糖酶有各種不同的作用，包括營(yíng)養(yǎng)和抑真菌作用。哈茨木霉P1的78kDa大小的β－1，3－葡聚糖酶有抑真菌活性。它能與內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)－β－1，4殼聚糖酶（chitin－β－1，4－chitobiase）阻止灰霉病菌的孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)，當(dāng)總蛋白質(zhì)濃度為10～20μg／mL時(shí)能徹底的抑制病原菌的孢子萌發(fā)和芽管的伸長(zhǎng)。

β－葡聚糖是木霉和粘帚霉細(xì)胞壁的重要組分之一，因此也容易受到葡聚糖裂解酶的作用［34］，但它們的細(xì)胞壁是如何避免自身產(chǎn)生的裂解酶之分解作用，這個(gè)問(wèn)題仍不完全清楚。有一種解釋認(rèn)為沒有活性的酶原蛋白從內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn)到外面，從而避開自身的細(xì)胞壁被裂解［36］。也探討了其他的可能性，即細(xì)胞壁組分中含有抑制裂解酶活性的物質(zhì)。Goldman等［37］從哈茨木霉重復(fù)寄生作用誘導(dǎo)產(chǎn)生的cDNA文庫(kù)中篩選得到3個(gè)編碼基因，編碼的蛋白質(zhì)分子量大小分別為69kDa，37kDa和15.6 kDa，其中分子量為15.6kDa的蛋白中含有一種基序，這種基序發(fā)現(xiàn)于富含絲氨酸和丙氨酸的結(jié)構(gòu)蛋白中，能夠抑制酶的水解作用［38］。另外，黑色素的可保護(hù)細(xì)胞壁免受裂解酶的水解。

一些β－葡聚糖酶和真菌的自溶有關(guān)系，但是這些酶在生理過(guò)程中的作用還沒有完全弄清楚，例如：在細(xì)胞壁組分更新中的作用、在缺乏營(yíng)養(yǎng)條件下細(xì)胞生存中的作用、與干擾細(xì)胞壁合成的殺菌劑之相互作用以及相關(guān)的一些現(xiàn)象之間的相互作用等方面。一些絲狀真菌在碳源受限的條件下形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，同時(shí)一些裂解酶活性會(huì)顯著增加，其中β－葡聚糖酶的作用被認(rèn)為是從貯存的β－葡聚糖為細(xì)胞提供能量。β－1，－3葡聚糖酶和β－1，6－葡聚糖酶參與老齡菌絲的自溶，而在菌絲的正常生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)影響結(jié)構(gòu)性葡聚糖而幫助菌絲的伸長(zhǎng)［39－40］。

4 展望

目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的病害防治主要還是依靠化學(xué)農(nóng)藥，而長(zhǎng)期大量化學(xué)農(nóng)藥的使用已經(jīng)對(duì)人和環(huán)境及周邊生物造成了很大的危害，因此近年來(lái)人們也越來(lái)越重視植物病害的生物防治。利用生物技術(shù)防治植物病害近年來(lái)發(fā)展迅速，木霉的葡聚糖酶能降解病原菌細(xì)胞壁中的葡聚糖，進(jìn)而使病原菌的細(xì)胞破裂，病原菌的生長(zhǎng)受到抑制，不能進(jìn)一步的侵染和危害農(nóng)作物。因此研究木霉葡聚糖酶及其編碼基因?qū)τ诜乐无r(nóng)作物的病害的具有非常重要的價(jià)值，利用其編碼基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物和微生物是防治農(nóng)作物病害的有效途徑。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日益完善和成熟，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注木霉葡聚糖酶及其編碼基因的研究。隨著研究的深入，未來(lái)利用木霉葡聚糖酶編碼基因創(chuàng)制出具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的生物防治菌或者轉(zhuǎn)基因植物，將具有可觀的應(yīng)用前景和巨大的市場(chǎng)潛力。

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