烏司他丁對(duì)急性百草枯中毒大鼠血漿中炎性細(xì)胞因子及MDA、SOD影響的研究

王 鑫，李 兵，孫桂芹，李愛(ài)軍，陳 寧

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

烏司他丁對(duì)急性百草枯中毒大鼠血漿中炎性細(xì)胞因子及MDA、SOD影響的研究

王 鑫，李 兵，孫桂芹，李愛(ài)軍，陳 寧

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

目的 觀察烏司他丁對(duì)急性百草枯中毒大鼠血漿中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6水平及丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響，探索急性百草枯中毒導(dǎo)致組織器官損傷的機(jī)制。方法 將126只SD健康成年大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、染毒組、治療組，染毒組和治療組分別給予腹腔內(nèi)一次性注射百草枯25mg/kg染毒, 之后治療組腹腔內(nèi)注射烏司他丁3×104μg/kg,每天1次，對(duì)照組和染毒組注射等量生理鹽水。3組于干預(yù)后1，3，7，14，21，28，35d各取6只，觀察比較血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6水平及MDA含量、SOD活力。結(jié)果 染毒后1，3，7，14，21d，染毒組TNF-α水平明顯高于對(duì)照組(P均<0.01)；染毒后3，7，14，21，28，35d，染毒組IL-1β水平明顯高于對(duì)照組(P均<0.01)；染毒后7，14，21，28，35d，染毒組IL-6水平明顯高于對(duì)照組(P均<0.01)。相應(yīng)時(shí)段治療組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均低于染毒組，但仍高于對(duì)照組。染毒后1d血漿MDA含量急劇上升，以后各時(shí)段呈逐漸下降趨勢(shì)，1，3，7，14，21d明顯高于對(duì)照組(P均<0.01)，同時(shí)段治療組MDA含量較染毒組明顯降低(P均<0.05)，但1，3，7d明顯高于對(duì)照組(P均<0.01)。染毒后1d,染毒組血漿SOD活力即明顯下降，以后各時(shí)段呈逐漸上升趨勢(shì)，1，3，7d明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，14d和21d時(shí)仍低于對(duì)照組(P均<0.05)；治療組各時(shí)段SOD活力均較染毒組明顯升高(P均<0.01)，但1d與3d時(shí)明顯低于對(duì)照組(P均<0.01)，7d時(shí)仍低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、SOD在急性百草枯中毒大鼠血漿中的含量發(fā)生改變，它們可能參與了百草枯導(dǎo)致組織器官損傷的過(guò)程；烏司他丁治療后各指標(biāo)均發(fā)生了變化，可能與烏司他丁較強(qiáng)的抗氧化、抑制炎癥遞質(zhì)釋放等功能有密切關(guān)系。

百草枯；中毒；細(xì)胞因子；烏司他丁

百草枯(PQ)是當(dāng)前世界范圍內(nèi)應(yīng)用極為廣泛的除草劑，隨著其在我國(guó)農(nóng)業(yè)上的推廣應(yīng)用，PQ中毒也日漸增多，其對(duì)人和動(dòng)物的毒性很高，其口服中毒病死率為50%～70%[1]。PQ可以經(jīng)消化道吸收、呼吸道吸入以及皮膚接觸等途經(jīng)進(jìn)入體內(nèi)，導(dǎo)致急性中毒。目前PQ中毒尚無(wú)特效解毒藥物，其發(fā)病機(jī)制也尚未完全清楚，因此PQ中毒所造成的機(jī)體生理病理改變成為目前中毒治療學(xué)研究的熱點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)分析急性PQ中毒大鼠模型血漿中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6水平及丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力及烏司他丁(ulinastatin,UTI)對(duì)各指標(biāo)的影響，探討急性PQ中毒導(dǎo)致組織器官損傷的機(jī)制以及烏司他丁對(duì)其的治療作用。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)成年健康SD大鼠126只，雌雄不拘，體質(zhì)量270～300 g,購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(冀)2011-0004。

1.2 材料及試劑 20%PQ溶液(英國(guó)先正達(dá)股份有限公司生產(chǎn))，烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z68240509)，TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒均由美國(guó)Rapidbio(R&B)公司生產(chǎn)， SOD及MDA檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備 將126只SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、染毒組、治療組，每組42只。染毒組及治療組腹腔內(nèi)一次性注射PQ 25 mg/kg建立中毒模型，對(duì)照組注射等量生理鹽水。之后治療組腹腔內(nèi)注射烏司他丁3×104μg/kg,每天1次，染毒組和對(duì)照組腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水，均直至留取標(biāo)本。

1.4 取材及樣品制備 3組在干預(yù)后1，3，7，14，21，28，35 d清晨空腹各取出6只，行乙醚麻醉后，分別從腹主動(dòng)脈采集非抗凝血1 mL，低溫下3 000 r/min離心15 min，取上清液，分裝于干燥的EP管中，放入-80 ℃冰箱冷凍存放。用ELISA法檢測(cè)血漿TNF-α、IL-1β、IL-6水平。采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定血漿中MDA含量。采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血漿中總SOD(T-SOD)的活力。

2 結(jié) 果

2.13組血漿TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 染毒后1～21 d，染毒組TNF-α水平明顯高于對(duì)照組(P均<0.01)，此后TNF-α水平下降，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；治療組相應(yīng)時(shí)段TNF-α水平均低于染毒組(P均<0.05)，但仍高于對(duì)照組(P均<0.01)。染毒組IL-1β從3 d開(kāi)始升高，7 d達(dá)到高峰，此后維持在較高水平，3，7，14，21，28，35 d均高于對(duì)照組(P均<0.01)，同時(shí)段治療組IL-1β水平均低于染毒組(P<0.01或P<0.05)，但3，7，14，21 d水平高于對(duì)照組(P均<0.01)，其余時(shí)段比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。染毒組IL-6水平升高時(shí)段較晚，從7 d開(kāi)始升高，21 d達(dá)到高峰，此后維持在較高水平，7，14，21，35 d均高于對(duì)照組(P均<0.01)，同時(shí)段治療組IL-6水平均低于染毒組(P均<0.05)，但仍高于對(duì)照組(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 3組MDA含量和SOD活力比較 染毒后1 d，染毒組血漿MDA含量急劇上升，以后各時(shí)段呈逐漸下降趨勢(shì)，1，3，7，14，21 d明顯高于對(duì)照組(P均<0.01)，28 d時(shí)仍高于對(duì)照組(P<0.05)，35 d時(shí)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)段治療組MDA含量較染毒組明顯降低(P均<0.05)，但1，3，7 d明顯高于對(duì)照組(P均<0.01)，14,21 d仍高于對(duì)照組(P均<0.05)，其他時(shí)段與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。染毒后1 d,染毒組血漿SOD活力即明顯下降，以后各時(shí)段呈逐漸上升趨勢(shì)，1,3,7 d明顯低于對(duì)照組(P均<0.01)，14 d和21 d時(shí)仍低于對(duì)照組(P均<0.05)，其他時(shí)段與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；治療組各時(shí)段SOD活力均較染毒組明顯升高(P<0.01)，但1 d與3 d時(shí)明顯低于對(duì)照組(P均<0.01)，7 d時(shí)仍低于對(duì)照組(P<0.05)，其他時(shí)段與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

3 討 論

PQ屬于有機(jī)雜環(huán)類、接觸性、非選擇性除草劑，易溶于水, 呈綠色、無(wú)味, 有腐蝕性，遇堿易分解，在酸性環(huán)境下較穩(wěn)定，其有效成分為1,1’-二甲基-4,4’-聯(lián)吡啶二氯化物。在國(guó)內(nèi)，PQ溶液的濃度一般為20%。若使用不當(dāng)、誤服及自殺性服用均可引起中毒，造成多器官損傷。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，PQ分子作為電子受體經(jīng)單電子傳遞被還原，然后再與氧分子(O2)反應(yīng)，生成聯(lián)吡啶陽(yáng)離子和超氧陰離子(O2-)，PQ的還原氧化過(guò)程導(dǎo)致高活性氧自由基激增，而高活性氧可以引起脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,導(dǎo)致TNF-α表達(dá)異常以及炎性遞質(zhì)釋放[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，染毒初期大鼠血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯增高，這說(shuō)明它們參與了組織損傷的病理過(guò)程。

表1 3組血漿TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

注：①與對(duì)照組比較，P<0.01；②與染毒組比較，P<0.05；③與染毒組比較，P<0.05。

表2 3組血漿MDA含量及SOD活力比較

注：①與對(duì)照組比較,P<0.01;②與對(duì)照組比較，P<0.05；③與染毒組比較，P<0.05；④與染毒組比較，P<0.01。

TNF-α主要是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，可促進(jìn)炎性細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)，使更多的細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)進(jìn)一步分泌和表達(dá)，形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。IL-1β主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它可以刺激肝臟合成急性期反應(yīng)蛋白，誘導(dǎo)IL-6的合成，上調(diào)炎性遞質(zhì)的表達(dá)，與TNF-α具有協(xié)同作用，促進(jìn)炎性細(xì)胞聚集。IL-6是血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥遞質(zhì)，作為對(duì)TNF-α、IL-1β、內(nèi)毒素等刺激反應(yīng)的第二信使，調(diào)控炎癥反應(yīng)及毒性作用。PQ中毒與細(xì)胞因子間不僅存在著密切的聯(lián)系，而且細(xì)胞因子的產(chǎn)生似乎還有一定的先后順序。本研究觀察到，大鼠染毒1 d，血漿TNF-α水平首先升高，并在染毒3 d達(dá)到最高峰，隨后逐步下降。繼TNF-α之后，IL-1β分泌也迅速增加。IL-6產(chǎn)生較晚，但在血漿內(nèi)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，PQ中毒早期釋放的TNF-α可能是重要的啟動(dòng)因子，上調(diào)中毒時(shí)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生。已有報(bào)道，IL-6可下調(diào)單核細(xì)胞合成TNF-α、IL-1β。在PQ中毒晚期，血漿TNF-α、IL-1β水平下降，可能與IL-6的逐步釋放增加有關(guān)[3]。本研究結(jié)果顯示，PQ中毒過(guò)程中，細(xì)胞因子連鎖反應(yīng)的啟動(dòng)和放大表現(xiàn)為一種復(fù)雜、相互依賴的關(guān)系。這些細(xì)胞因子可以相互誘生，協(xié)同作用，從而在PQ中毒過(guò)程中形成一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，這對(duì)PQ中毒的進(jìn)展和嚴(yán)重程度有重要影響。

正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基很少，且組織細(xì)胞內(nèi)存在著抗氧化酶系來(lái)阻止自由基的損傷，SOD是重要的抗氧化酶，它作用的底物是超氧陰離子自由基[4]。超氧陰離子自由基是所有氧自由基中第一個(gè)自由基，因此對(duì)它的清除十分重要。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)終末代謝產(chǎn)物[5]，因此，測(cè)定MDA即可反映組織細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接地反映出器官損傷的程度。MDA的測(cè)定經(jīng)常與SOD的測(cè)定相互結(jié)合。MDA含量的高低間接反映了自由基損傷組織器官的嚴(yán)重程度，而SOD活力的高低又間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠染毒1 d，血漿中MDA含量達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，而SOD活力達(dá)最低點(diǎn)，隨后逐漸回升，提示染毒大鼠體內(nèi)自由基明顯增多，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，從而誘發(fā)組織損傷。

烏司他丁是143個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，是典型的Kuniz型廣譜蛋白酶抑制劑[6]。烏司他丁更重要的作用是能夠抑制氧自由基的產(chǎn)生,阻止多種炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，從而阻斷細(xì)胞因子觸發(fā)炎癥遞質(zhì)的瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，烏司他丁明顯抑制了PQ染毒大鼠血漿中MDA的升高，同時(shí)也提高了血漿中SOD的活性，其機(jī)制可能與其清除氧自由基、提高機(jī)體抗氧化酶的活力、改變抗氧化酶的基因表達(dá)有關(guān)。本研究也顯示烏司他丁能減輕PQ染毒大鼠血漿中炎性細(xì)胞因子的水平可能是其保護(hù)組織結(jié)構(gòu)與功能的機(jī)制之一。結(jié)合本研究結(jié)果及晚近有關(guān)文獻(xiàn)資料，筆者推測(cè)烏司他丁可能通過(guò)阻斷PQ誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧自由基與細(xì)胞因子間的惡性循環(huán)，抑制蛋白酶活性和氧自由基的釋放，進(jìn)而減輕組織細(xì)胞的損傷,這還有待于進(jìn)一步的研究探討。

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Effects of ulinastatin on plasma inflammatory cytokines, MDA and SOD of rats with acute paraquat poisoning

WANG Xin, LI Bing, SUN Guiqin, LI Aijun, CHEN Ning

(Handan Central Hospital, Handan 056002, Hebei, China)

Objective It is to evaluate the effects of ulinastatin(UTI) on the levels of inflammatory cytokines like TNF-α, IL-1β, IL-6, the content of MDA and activity of SOD in the plasma of acute paraquat-induced rats so as to investigate the mechanism of the paraquat injuring tissue. Methods One hundred and twenty-six healthy adult Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into three groups: control group, poisoned group, treatment group. The poisoned group and treatment group was poisoned with 25 mg/kg paraquat by intraperitoneal injection, then the treatment group was given ulinastatin 3×104μg/kg by intraperitoneal injection once a day, and the control group and poisoned group was given the same volume of normal saline. On 1st, 3rd,7th, 14th, 21st, 28th and 35th day，six rats in each group were used to assess the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, the content of MDA and activity of SOD in the plasma. Results Compared with control group, the levels of TNF-α in poisoned group were significantly higher on the 1st day-21st day (P<0.01), the levels of IL-1β on the 3rd day-35th day (P<0.01), the levels of IL-6 on the 7th day-35th day (P<0.01) were also higher; Whereas the increases of these inflammatory cytokines were markedly inhibited in treatment group, in which the levels in some periods were still higher than that of control group. The levels of plasma MDA in poisoned group increased much after poisoning and gradually decreased at the next time stage, but they were significantly higher than that in control group on the 1st day-21st day (P<0.01); However the increases of MDA were markedly inhibited in treatment group, in which the levels were lower than that in the poisoned group at the same time stage but still higher than that in the control group on the 1st day-21st day (P<0.01). The activity of plasma SOD in poisoned group decreased much after poisoning and gradually increased at the next time stage, but they were significantly lower than that in control group on the 1st day-7th day (P<0.01), 14th day-21st day (P<0.05); However the activity in treatment group were higher than that in poisoned group at every time stage (P<0.01), but still lower than that in the control group on the 1st day-the 3rd (P<0.01) and on 7th day (P<0.05). Conclusion The levels of inflammatory cytokines like TNF-α, IL-1β, IL-6, MDA and the activity of SOD in plasma of acute paraquat-induced rats were changed. They could participate in the mechanism leading to tissue damage. The indexes were improved by ulinastatin, which might be closely related with its antioxidant effect and inhibition of inflammatory cytokines releasing.

paraquat; poisoning; inflammatory cytokines; ulinastatin

王鑫，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)榧痹\醫(yī)學(xué)。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.23.006

R

A

1008-8849(2015)23-2527-04

2015-01-09