髓樣分化因子88抑制劑ST2825對重組恥垢分枝桿菌感染THP-1細胞自噬的影響

胡少婷，李升錦，黃秦

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400010）

·論著·

髓樣分化因子88抑制劑ST2825對重組恥垢分枝桿菌感染THP-1細胞自噬的影響

胡少婷，李升錦，黃秦

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400010）

目的探討髓樣分化因子88抑制劑ST2825對重組恥垢分枝桿菌感染THP-1細胞自噬的影響。方法使用髓樣分化因子88抑制劑ST2825作用于重組恥垢分枝桿菌感染的THP-1細胞，確定ST2825干預(yù)的實驗組、無ST2825作用的對照組以及空白組。運用熒光顯微鏡觀察自噬小體，RT-PCR檢測Beclin-1基因和Bcl-2基因的mRNA的表達。結(jié)果與對照組比較，實驗組的自噬熒光小點數(shù)目明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；RT-PCR檢測結(jié)果顯示Beclin-1和Bcl-2mRNA表達較對照組下調(diào)。結(jié)論髓樣分化因子88抑制劑ST2858可能通過干擾Beclin-1和Bcl-2的分離，抑制THP-1細胞自噬。

髓樣分化因子88；ST2825；重組恥垢分枝桿菌

自噬是巨噬細胞執(zhí)行免疫防御的重要手段，巨噬細胞通過自噬可殺滅入侵的病原微生物，其中包括結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）。在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細胞內(nèi)，在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下，形成自噬體結(jié)構(gòu)。自噬體形成后可與溶酶體融合，并借助于溶酶體酸性環(huán)境降解入侵的MTB，達到免疫防御的目的。MTB以及其組成成分，可通過Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）識別后激活機體免疫反應(yīng)。髓樣分化分子88（myeloid differentiation factor 88，Myd88）是TLRs信號途徑的重要轉(zhuǎn)載分子，ST2825是Myd88特異性免疫抑制劑，可阻斷TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［1］。本研究通過觀察Myd88抑制劑ST2825對重組恥垢桿菌感染THP-1細胞形成自噬小體、自噬相關(guān)基因表達的影響，探討Myd88在調(diào)節(jié)細胞自噬中的作用，為尋求以Myd88為作用點研究新的抗結(jié)核藥物加強宿主巨噬細胞自噬作用，更有力清除機體內(nèi)MTB提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

重組恥垢桿菌MS-pMV-eis（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院檢驗科保存）、LB培養(yǎng)基（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院中心實驗室）、人單核巨噬細胞THP-1細胞（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院中心實驗室）、自噬體熒光表達質(zhì)粒GFP-LC3質(zhì)粒（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院檢驗科保存）、pCDNA3.1-3flag質(zhì)粒（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院檢驗科保存），Beclin-1引物和Bcl-2引物（大連寶生物公司）、RNA提取劑（大連寶生物公司）、細胞培養(yǎng)用1640培養(yǎng)基+胎牛血清（Hyclone）、雷帕霉素（上海生物工程有限公司）、PMA（Sigma公司）、ST2825（美國MCE公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)：從平板上挑取MS-pMV-eis，接種于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基（燒瓶），在37℃下震蕩培養(yǎng)下培養(yǎng)7 d，取對數(shù)生長期細菌用RMPI1640培養(yǎng)液重懸浮，調(diào)整濃度為1×105/mL。

1.2.2 THP-1細胞的制備及培養(yǎng)：采用含有10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)THP-1細胞，加入PMA培養(yǎng)24 h使細胞分化為貼壁的巨噬細胞，棄去培養(yǎng)液，調(diào)整為1×104/mL鋪于6孔板。

1.2.3 重組恥垢分枝桿菌感染細胞模型的制備：THP-1細胞標(biāo)本分為3組：實驗組（THP-1細胞+MS-pMV-eis）、對照組（THP-1細胞+MS-pMV-eis）、空白組（THP-1細胞）。按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）10∶1的比例以MS-pMV-eis感染實驗組及對照組的THP-1細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 藥物干預(yù)：上述細胞和細菌共培養(yǎng)48 h后，將實驗組細胞棄去培養(yǎng)液，加入濃度為20 μmol/L ST2825，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.5 自噬體檢測：上述各組細胞將空質(zhì)粒pCDNA3.1-3flag質(zhì)粒（0.4 μg）與GFP-LC3質(zhì)粒（0.4 μg）共轉(zhuǎn)染細胞，具體轉(zhuǎn)染方法按試劑說明書進行。轉(zhuǎn)染6 h后換液，熒光顯微鏡下觀察各組細胞中自噬熒光小點的形成數(shù)目。

1.2.6 RT-PCR檢測自噬基因Beclin-1和抑制自噬基因Bcl-2的表達水平：上述各組細胞收集后運用RNA提取試劑提取總RNA。GAPDH及Beclin-1、Bcl-2引物序列由大連寶生物合成，以GAPDH作內(nèi)對照（表1）。PCR擴增條件：94℃5 min；94℃40 s，56℃30 s，72℃32 s，共35個循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液1 μL進行瓊脂糖膠電泳，確認RT-PCR產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

表1 各基因引物序列Tab.1 Gene primer sequences

2 結(jié)果

2.1 ST2825影響自噬小體表達情況

熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組細胞均可觀察到自噬熒光小點，但在ST2825作用下，THP-1細胞中自噬熒光小點數(shù)目明顯減少（7±2），而對照組細胞中自噬熒光小點數(shù)目較多（112±3），2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明Myd88在THP-1細胞的自噬形成過程中起著重要作用（圖1）。

2.2 ST2825影響B(tài)eclin-1和Bcl-2mRNA表達情況

用RT-PCR在RNA水平上檢測Beclin-1和Bcl-2 mRNA的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用ST2825處理細胞后，實驗組的Beclin-1和Bcl-2的條帶較對照組變暗變窄，表示上述基因的表達較對照組明顯下調(diào)，表示Myd88影響其表達，見圖2。

3 討論

自噬作為胞內(nèi)物質(zhì)降解的通路，在機體的抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用，尤其在對抗MTB等胞內(nèi)病原體感染過程中，宿主細胞可以通過自噬識別并靶向清除胞內(nèi)菌。近期研究發(fā)現(xiàn)TLRs能夠識別MTB及其組分，直接啟動天然免疫，也可以同時上調(diào)抗原提呈細胞表面的主要組織性復(fù)合物Ⅱ分子和共刺激分子的表達，誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答?，F(xiàn)國外研究發(fā)現(xiàn)TLRs可介導(dǎo)自噬，并增強巨噬細胞的殺菌效應(yīng)。Shin等［2］報導(dǎo)MTB的脂蛋白LpqH與巨噬細胞表面的TLR2/CD14結(jié)合，可啟動AMPK和p38-MAPK信號途徑，啟動抗菌肽，抗菌肽表達后可誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因及蛋白的表達，形成自噬小體。除TLR3外，其他TLR都完全或部分依賴于Myd88轉(zhuǎn)到信號，因此Myd88是TLRs途徑的關(guān)鍵分子點。阻斷Myd88依賴性信號通路，增加宿主感染化膿性細菌、皰疹病毒的機會［3］。

圖1 熒光顯微鏡下觀察各組THP-1細胞的自噬小體的表達 ×40Fig.1 Counting of autophagosomes of THP-1 cells in different groups under fluorescence microscopy×40

圖2 RT-PCR檢測各組THP-1細胞的Beclin-1和Bcl-2基因的mRNA的表達變化Fig.2 Expression of Beclin-1mRNA and Bcl-2mRNA in THP-1 cells detected by RT-PCR

Myd88在1900年首次認為是髓樣分化初級反應(yīng)的基因，本質(zhì)上是一種胞質(zhì)可溶性蛋白，其結(jié)構(gòu)上有3個功能區(qū)域：N端死亡區(qū)域（death domain，DD）、中間區(qū)域、C端區(qū)域。它的DD區(qū)類似于IL-1受體的胞質(zhì)區(qū)，通過招募鏈接蛋白傳遞信號；中間區(qū)域與白細胞介素1受體相關(guān)激酶（interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK）作用有關(guān)，在TLR信號通路中能誘導(dǎo)啟動NF-κB、P38、JNK［4，5］。已有實驗證明，myd88基因在抵御及清除卡介苗方面發(fā)揮重要作用。德國研究者敲除小鼠Myd88基因后，與正常組感染相同數(shù)量的卡介苗5 d后，CT檢查發(fā)現(xiàn)基因敲除組小鼠的肺、肝臟、脾臟均可看到熒光素陽性區(qū)域，而正常組未發(fā)現(xiàn)［6］。有學(xué)者［1］發(fā)現(xiàn)敲除小鼠Myd88基因的外顯子1和2部分，其鼠感染卡介苗后不能清除卡介苗，表示該小鼠清除卡介苗的能力被破壞［7］。

本實驗以設(shè)計ST2825干預(yù)重組恥垢分枝桿菌感染THP-1細胞的模型，觀察Myd88特異性抑制劑ST2825對THP-1細胞自噬的影響，試圖為研究以Myd88為作用點的藥物調(diào)節(jié)自噬，增強機體抗結(jié)核效應(yīng)提供依據(jù)。既往Loiarro等［1］已經(jīng)證明ST2825是以Myd88 TIR域BB環(huán)七肽為模板進行合成的，能特異性抑制Myd88的TIR區(qū)域的同源二聚化作用及下游信號分子IL-1受體相關(guān)激酶4（interleukin-1 receptor assiociated kinase4，IRAK4）、IRAK1活性，進而不能激活NF-κB、P38和JNK信號途徑。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組恥垢桿菌感染的THP-1細胞在熒光顯微鏡下可觀察到大量的自噬小體，而加入ST2825干預(yù)后，自噬小體數(shù)量明顯減少。同時運用RT-PCR檢測檢測自噬相關(guān)基因Beclin-1和抑制自噬基因Bcl-2的mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)實驗組兩基因的mRNA表達較對照組下調(diào)明顯。上述實驗結(jié)果表示ST2825可抑制自噬的形成，并干預(yù)Beclin-1基因和Bcl-2基因的表達。本研究結(jié)果說明Myd88可調(diào)節(jié)THP-1細胞自噬形成及相關(guān)基因的表達。之前Shi等［8］將shRNAs沉默Myd88基因，用LPS刺激該基因沉默的RAW264.7細胞，在電子顯微鏡下觀察到正常組的自噬小體數(shù)目明顯高于基因沉默組，與本研究結(jié)論相一致。Bcl-2作為抗凋亡蛋白，在正常情況下與Beclin-1持續(xù)結(jié)合，抑制自噬，而進一步運用免疫共沉淀方法發(fā)現(xiàn)Myd88可干預(yù)Beclin-1和Bcl-2的分離，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［8］。在本實驗中發(fā)現(xiàn)Myd88抑制劑ST2825可導(dǎo)致THP-1細胞的Beclin-1基因和Bcl-2基因的表達下調(diào)，證實了Shi等［8］的研究觀點。故我們推測ST2825通過干擾Beclin-1和Bcl-2的分離抑制自噬。

［1］Loiarro M，Capolunghi F，F(xiàn)antò N，et al.Pivotal advance：Inhibition of MyD88 dimerization and recruitment of IRAK1 and IRAK4 by a novel peptidomimetic compound［J］.Leuko Biol，2007，82（4）：801-810.

［2］Shin DM，Yuk JM，Lee HM，et al.Mycobacterial lipoprotein activates autophagy via TLR2/1/CD14 and a functional vitamin D receptor signaling［J］.Cell Microbiol，2010，12（11）：1648-1665.

［3］Netea MG，Wijmenga C，O'Neill LA.Genetic variation in Toll-like receptors and disease susceptibility［J］.Nat Immunol，2012，13（6）：535-542.

［4］吳燕燕，王易.Toll樣受體信號通路中MyD88的研究進展［J］.免疫學(xué)，2012，28（3）：262-265.

［5］Warner N，Nú?ez G.MyD88：A critical adaptor protein in innate immunity signal transduction［J］.J Immunol，2013，190（1）：3-4.

［6］Berod L，Stüve P，Swallow M，et al.MyD88 signalling inmyeloid cells is sufficient toprevent chronic mycobacterial infection［J］.Eur J Immunol，2014，44（5）：1399-1409.

［7］Gais P，Reim D，Jusek G，et al.Cutting edge：divergent cell-specific functions of MyD88 for inflammatory responses and organ injury in septic peritonitis［J］.Immunology，2012，188（12）：5833-5837.

［8］Shi CS，Kehrl JH.MyD88 and trif target Beclin 1 to trigge autophagy in macrophages［J］.Biol Chem，2008，283（48）：33175-33182.

（編輯武玉欣）

The Effect of Myeloid Differentiation Factor 88 Inhibitor ST2825 on the Autophagy of THP-1 Cells Infected with Recombinant Mycobacterium smegmatis

HU Shao-ting，LI Sheng-jin，HUANG Qin

（Department of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China）

Objective To investigate the effect of myeloid differentiation factor88 inhibitor ST2825 on the autophagy of THP-1 cells infected by recombinant mycobacterium smegmatis.MethodsThe myeloid differentiation factor 88 inhibitor ST2825 was applied on the THP-1 cells infected by recombinant mycobacterium smegmatis，and three groups were defined：the test group with ST2825 treatment，the control group without ST2825 treatment，and the blank group.Autophagosomes were observed under the fluorescence microscope，and the mRNA expression of Beclin-1gene and Bcl-2gene was analyzed by RT-PCR.ResultsCompared with the control group，the number of autophagy fluorescent dots in the test group was obviously reduced（P＜0.05），and the expression levels of Beclin 1 gene and Bcl-2 gene were declined as indicated by the RT-PCR detection.ConclusionThe myeloid differentiation factor 88 inhibitor ST2825 might inhibit the autophagy of THP-1 cells through interfering the separation of Beclin-1 and Bcl-2.

myeloid differentiation factor 88；ST2825；recombinant mycobacterium smegmatis

R372

A

0258-4646（2015）06-0562-04

胡少婷（1989-），女，碩士研究生.

李升錦，E-mail：lsj1025@163.com

2015-01-03

網(wǎng)絡(luò)出版時間：