調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在冠心病與牙周炎相互關(guān)系中的作用

丁暢，黃進(jìn)，陸治平，王倩

? 論著 ?

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在冠心病與牙周炎相互關(guān)系中的作用

丁暢，黃進(jìn)，陸治平，王倩

目的探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在牙周炎促進(jìn)冠心病進(jìn)展中所起的作用。方法將90例患者依據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果及牙周炎Armitage診斷標(biāo)準(zhǔn)分為：胸痛綜合征組（CPS組）、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┙M（CHD組）和冠心病合并牙周炎組（CHD-P組）；再將CHD-P組分為冠心病合并輕、中度牙周炎組（CHD-P1組）、冠心病合并重度牙周炎組（CHD-P2組）。采用流式細(xì)胞儀分析CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占T淋巴細(xì)胞的比例。結(jié)果Gensini評(píng)分CHD-P2組（65.86±39.94）較CHD-P1組（31.23±33.53）和CHD組（13.09±7.59）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CHD-P1組較CHD組Gensini評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T在CHD-P組為[（1.93±0.46）%]較CHD組[（2.32±0.72）%] 和CPS組 [（2.54±0.95）%] 明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論牙周炎使冠心病患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步下降，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與牙周炎促進(jìn)冠心病的進(jìn)展密切相關(guān)。

冠心??；牙周炎；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；動(dòng)脈粥樣硬化

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦且环N多因素疾病，其準(zhǔn)確的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚，吸煙、高血壓、高血脂、肥胖和糖尿病等是傳統(tǒng)的冠心病的危險(xiǎn)因素。然而，近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子與冠心病密切相關(guān)，其中牙周炎可能是誘導(dǎo)冠心病發(fā)生的又一危險(xiǎn)因素[1]。

牙周炎可以增加系統(tǒng)炎癥因子的水平，進(jìn)而誘發(fā)或加劇血管壁的動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）病理進(jìn)程[2]。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫參與了AS的炎癥反應(yīng)過(guò)程，在促進(jìn)斑塊進(jìn)展和保持斑塊穩(wěn)定中都起一定作用[3,4]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的數(shù)量減少或者功能降低都會(huì)導(dǎo)致自身免疫失調(diào)，這可能是T淋巴細(xì)胞參與AS進(jìn)展的重要作用機(jī)制[5]。本研究希望通過(guò)檢測(cè)患者的CD4+CD25+FoxP3+Treg含量，分析牙周炎對(duì)冠心病患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的影響，為進(jìn)一步闡明牙周炎與冠心病的關(guān)系提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

納入2012年1月至2013年10月于南京市胸科醫(yī)院心血管內(nèi)科首診疑似冠心病的住院患者90例，其中男52例，女38例，年齡（62.21±9.62）歲。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果和牙周炎Armitage診斷標(biāo)準(zhǔn)將患者分為三組:胸痛綜合征組（CPS組）26例，男15例，女11例，年齡（58.6±9.0）歲，CPS定義為有胸痛但不伴有心電圖的改變和冠狀動(dòng)脈狹窄及痙攣、同時(shí)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果正常；冠心病組（CHD組）22例，男13例，女9例，年齡（64.84±10.30）歲；冠心病合并牙周炎組（CHD-P組）42例，男24，女18例，年齡（63.08±9.17）歲。再根據(jù)牙周炎的嚴(yán)重程度將冠心病合并牙周炎組（CHD-P組）分為①冠心病合并輕中度牙周炎組（CHD-P1組）20例；②冠心病合并重度牙周炎組（CHD-P2組）22例。

排除標(biāo)準(zhǔn)：曾經(jīng)予以冠心病規(guī)范化治療的患者；合并嚴(yán)重的肝腎功能不全者；周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病者；惡性腫瘤患者；糖尿病和風(fēng)濕性疾病患者。此外，合并感染性疾病如敗血癥、嚴(yán)重的上呼吸道感染、肺部或肝膽道感染等、高熱及應(yīng)用炎癥抑制藥物如非甾體類抗炎藥、類固醇及鴉片類藥物等均予以剔除。研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲取研究對(duì)象的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 冠狀動(dòng)脈造影及冠狀動(dòng)脈狹窄評(píng)分采用Judkin’s技術(shù)進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影，依據(jù)哈里森內(nèi)科學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)：前降支（LAD）、回旋支（LCX）或右冠脈（RCA）及其分支中、或左主干（LM）存在＞50%直徑的固定性狹窄或阻塞性病變。冠狀動(dòng)脈狹窄程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用Gensini（GS）評(píng)分法。

1.2.2 牙周炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)由牙周科醫(yī)生測(cè)量并記錄每例受檢者缺失牙情況、全口牙周袋深度（PD）、臨床附著喪失（CAL）、探診出血指數(shù)（BOP）及牙齒松動(dòng)度（TM），參照Armitage 診斷標(biāo)準(zhǔn)將牙周炎分為：輕度（平均CAL0.6～1.5 mm ，鄰面部位CAL＜3 mm，缺失牙≤3顆）、中度（平均CAL 1.6～2.4 mm，口內(nèi)至少3個(gè)區(qū)或至少6顆牙齒但不超過(guò)8個(gè)部位鄰面CAL≥3 mm ，缺失牙≤5顆）、重度（平均CAL≥2.5 mm，口內(nèi)3個(gè)區(qū)有1個(gè)或多個(gè)部位鄰面CAL≥5 mm，缺失牙≤14顆），以上拔出第三磨牙、正畸拔牙、外傷導(dǎo)致牙脫落及先天缺牙均除外。

1.2.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)的檢測(cè)靜脈血1 ml用PBS 1:1稀釋，緩慢加入等量的人淋巴細(xì)胞分離液中，2200 rpm水平離心20 min，取單個(gè)核細(xì)胞層，加入PBS洗滌，1500 rpm水平離心10 min，去上清液；取A（同型對(duì)照管）、B（檢測(cè)管）兩管，每管加約5.0×105個(gè)細(xì)胞，以CD4/CD25混合抗體4℃避光孵育30 min，洗滌后加入1 ml固定/破膜工作液，4℃避光孵育60 min，A管加入IgG抗體，B管加入Foxp3抗體，4℃避光孵育30 min，洗滌后加適量流式緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，數(shù)據(jù)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行分析，多組均數(shù)間采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 —般資料CPS組與CHD組的年齡、總膽固醇（TC）有差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CPS組、CHD組和CHD-P組，三組在性別、吸煙率、血壓、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

年齡和TC均系CHD已知危險(xiǎn)因素，本調(diào)查研究使用方差分析（One-way ANOVA）結(jié)果提示：在分析牙周炎與CHD關(guān)系時(shí)應(yīng)將它們作為混雜因素排除。用多因素Logistic回歸分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)上可排除年齡（OR值2.815，P值0.093）和TC（OR值2.418，P值0.120）對(duì)CHD的影響（P＞0.05）。

2.2 冠心病患者冠狀動(dòng)脈狹窄程度G S（Gensini）評(píng)分的比較排除CPS組僅選取CHD組及CHD-P組患者，進(jìn)行冠狀動(dòng)脈粥樣狹窄程度的比較。結(jié)果CHD組的GS評(píng)分為（13.09 ±7.59），CHD-P1組的GS評(píng)分為（31.23± 33.53），CHD-P2組的GS評(píng)分為（65.86± 39.94）。GS評(píng)分CHD-P2組較CHD-P1組和CHD組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GS評(píng)分CHD-P1組較CHD組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 CPS組、CHD組、CHD-P組一般資料比較

2.3 各組患者CD4+CD25+T細(xì)胞占單核細(xì)胞（PBMC）的比率（圖1）CD4+CD25+T/PBMC在CHD-P組為[（7.92±2.96）%]、CHD組為[（7.64 ±3.05）%]、CPS組為[（8.50±3.27）%]，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯示CD4+CD25+T/PBMC在CHD-P組、CHD組、CPS組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）（表2）。

2.4 各組患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)的分析（圖2）CD4+CD25+Foxp3+Treg/ CD4+T在CHD-P組中為 [（1.93±0.46）%] 較CHD組 [（2.32±0.72）%] 和CPS組 [（2.54± 0.95）%] 明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CHD組CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T較CPS組降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

圖1 CPS組、CHD組、CHD-P組患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞在PBMC中的比率

圖2 CPS組、CHD組、CHD-P組患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比率

表2 CHD-P、CHD、CPS組CD4+CD25+T、CD4+CD25+Foxp3+Treg的比較

3 討論

冠心病是目前威脅人類生命健康的首要疾病之一。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為冠心病的主要病因是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，但迄今為止AS的原因尚不完全清楚，可能是多種因素綜合作用的結(jié)果，炎癥反應(yīng)可能是導(dǎo)致冠心病進(jìn)展的危險(xiǎn)因素之一。1999年Ross明確提出“動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病”，認(rèn)為AS并非單純是脂質(zhì)沉積，機(jī)體的炎癥反應(yīng)是突出的表現(xiàn)，它在AS斑塊的形成中起著重要作用。

近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，牙周炎與心血管疾病的發(fā)生具有密切聯(lián)系。2001年，Beck等[6]評(píng)估了不同年齡段的921名無(wú)心血管病人群，經(jīng)過(guò)18年隨訪發(fā)現(xiàn)牙槽骨吸收與心血管病患病之間存在相關(guān)性，在校正了年齡、吸煙、血清膽固醇水平、血壓等因素后，發(fā)現(xiàn)牙周狀況是預(yù)測(cè)心血管病風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)。Schillinger和Holmlund等[7,8]的研究也顯示牙周炎癥程度，特別是牙周炎引起缺失牙數(shù)目，與冠脈狹窄程度相關(guān)。Bahekar等[9]對(duì)五項(xiàng)牙周病與心血管病關(guān)系的前瞻性研究進(jìn)行了Meta分析，結(jié)果顯示牙周炎患者患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)是牙周健康者的1.4倍，牙數(shù)少于十顆患者患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.24倍。本研究結(jié)果顯示CHD-P2組較CHD組和CHD-P1組GS評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CHD-P1組較CHD組GS評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究結(jié)果提示牙周炎的嚴(yán)重程度與冠狀動(dòng)脈的狹窄程度呈正比，牙周炎可能促進(jìn)了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。

冠心病與牙周炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在著相關(guān)性，其可能的機(jī)制主要有以下幾點(diǎn)：①牙周炎患者常有一些不良的生活習(xí)慣（如吸煙、肥胖、糖尿病、缺乏運(yùn)動(dòng)、飲食習(xí)慣的改變等），這些習(xí)慣也是誘發(fā)AS的危險(xiǎn)因素。②牙周致病菌或其產(chǎn)物能進(jìn)入患者的血液循環(huán)，并直接入侵患者的心血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，引起血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)AS形成。③牙周炎患者牙周組織的局部會(huì)出現(xiàn)前列腺素、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子及C反應(yīng)蛋白（CRP）等炎癥介質(zhì)的大量表達(dá)，從而引發(fā)血小板的聚集和黏附，促進(jìn)脂質(zhì)細(xì)胞形成和血管內(nèi)膜膽固醇沉積，加速血管平滑肌肥大，導(dǎo)致管壁增厚，促進(jìn)AS的形成[2]。

牙周炎多數(shù)是牙齦卟啉單胞菌感染引起的，牙齦卟啉單胞菌感染誘導(dǎo)出T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)從而促進(jìn)了AS。Treg是一批具有免疫抑制功能的T細(xì)胞，分泌免疫抑制因子白細(xì)胞介素-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1等，以調(diào)節(jié)自身T細(xì)胞反應(yīng)為主要功能，Treg可能使冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊更趨于穩(wěn)定[10]。CD4+CD25+Foxp3+Treg為Treg中最重要的一類細(xì)胞，約占人和小鼠外周血CD4+T細(xì)胞的5%～10%，表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是其特征性的標(biāo)志。多種功能分子參與了Treg的免疫抑制功能，但控制其功能的核心是Foxp3。Treg數(shù)目的決定環(huán)節(jié)是其分化過(guò)程，實(shí)質(zhì)上就是Foxp3被誘導(dǎo)表達(dá)的過(guò)程。2009年，Wiqren等[11]利用含鋁佐劑疫苗免疫ApoE-/-小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠AS斑塊面積減小且病變嚴(yán)重程度減輕，同時(shí)小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)目增高，提示Treg激活可抑制AS形成。2013年，Roland等[12]利用白喉毒素注射獲得Foxp3選擇性缺失的小鼠，將Foxp3缺失小鼠骨髓移植至Ldlr-/-小鼠，結(jié)果顯示Foxp3定向缺失后AS斑塊明顯比對(duì)照組增大，血漿TC和TG水平也明顯增高，由此直接證明了Foxp3+Treg可通過(guò)調(diào)節(jié)脂蛋白代謝抑制AS。

本研究分析顯示CD4+CD25+T/PBMC在CHD-P組、CHD組、CPS組間無(wú)明顯差異，提示尚未分化成調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的CD4+CD25+T細(xì)胞在三組患者體內(nèi)的分布基本相同。實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步分析了三組患者CD4+CD25+FoxP3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比率，發(fā)現(xiàn)CHD-P組較CHD組和CPS組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CHD組雖較CPS組降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。我們推測(cè)CHD組、CPS組間無(wú)明顯差異，可能是由于CHD組患者的炎癥反應(yīng)相對(duì)比較輕微，或者CHD組樣本量偏小所致。CD4+CD25+FoxP3+Treg/CD4+T在單純冠心病、冠心病合并牙周病的患者中均是下降的，而且冠心病合并牙周病患者比單純冠心病患者下降更加明顯，提示牙周炎使冠心病患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步下降，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與牙周炎促進(jìn)冠心病的進(jìn)展密切相關(guān)。

綜上所述，牙周炎可能通過(guò)被感染的牙周組織釋放炎癥介質(zhì)、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等作用促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[13]。在上述炎癥反應(yīng)過(guò)程中，以CD4+CD25+Foxp3+Treg為代表的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞參與的動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。牙周炎引起冠心病患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的進(jìn)一步降低，打破了機(jī)體維持外周自身免疫應(yīng)答的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的活化和進(jìn)展。因此，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與牙周炎促進(jìn)冠心病進(jìn)展的作用密切相關(guān)，本研究為冠心病的診斷和治療提供了新的思路。

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Role of regulatory T cell in relationship between coronary heart disease and periodontitis

DING Chang*, HUANG Jin, LU Zhi-ping, WANG Qian.*Department of Cardiology, Chest Hospital of Nanjing City, Nanjing 210029, China.

HUANG Jin, E-mail: huangjin6310@sina.com

ObjectiveTo investigate the role of regulatory T cells in progress of coronary heart disease (CHD) promoted by periodontitis.MethodsCHD patients (n=90) were divided, according to outcomes of coronary angiography (CAG) and Armitage diagnostic criteria of periodontitis, into chest pain syndrome group (CPS group, CHD group and CHD combining periodontitis group (CHD-P group), and then CHD-P group was further divided into CHD-P1 group (CHD combining mild-moderate periodontitis) and CHD-P2 group (CHD combining severe periodontitis). The proportion of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in regulatory T cells was analyzed by using flow cytometry.ResultsGensini scores increased significantly in CHD-P2 group (65.86±39.94) compared with CHD-P1 group (31.23±33.53) and CHD group (13.09±7.59, P＜0.05). Gensini scores increased significantly in CHD-P1 group compared with CHD group (P＜0.05). CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T decreased in CHD-P group [(1.93±0.46)%] compared with CHD group [(2.32±0.72)%] and CPS group [(2.54±0.95)%, P＜0.05].ConclusionThe quantity of regulatory T cells can be reduced further by periodontitis, so regulatory T cells is closely correlated to progress of CHD promoted by periodontitis.

Coronary heart disease; Periodontitis; Regulatory T cells; Atherosclerosis

R541.4

A

1674-4055(2015)03-0309-04

2015-01-04）

（責(zé)任編輯：張靈）

江蘇省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(H201243)

210029 南京,南京市胸科醫(yī)院心血管內(nèi)科

黃進(jìn),E-mail:huangjin6310@sina.com

10.3969/j.1674-4055.2015.03.06