單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)的原理與應(yīng)用

柳延虎，王璐,2，于黎,2

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單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)的原理與應(yīng)用

柳延虎1，王璐1,2，于黎1,2

1. 云南大學(xué)，云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650091；2. 云南大學(xué)，云南省高校動(dòng)物遺傳多樣性與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650091

單分子DNA測(cè)序技術(shù)是近10年發(fā)展起來的新一代測(cè)序技術(shù)，也稱為第三代測(cè)序技術(shù)，包括單分子實(shí)時(shí)測(cè)序、真正單分子測(cè)序、單分子納米孔測(cè)序等技術(shù)。文章介紹了單分子實(shí)時(shí)(Single-molecule real-time，SMRT)測(cè)序技術(shù)的基本原理、性能以及應(yīng)用。與Sanger測(cè)序法和下一代測(cè)序技術(shù)相比，SMRT測(cè)序具有超長讀長、測(cè)序周期短、無需模板擴(kuò)增和直接檢測(cè)表觀修飾位點(diǎn)等特點(diǎn)，為研究人員提供了新選擇。同時(shí)，SMRT測(cè)序的低準(zhǔn)確率備受爭(zhēng)議(約85%)，其中約93%的錯(cuò)誤是插入缺失，因此，其數(shù)據(jù)應(yīng)用于基因組組裝前需先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行糾錯(cuò)處理。目前，SMRT測(cè)序在小型基因組從頭測(cè)序和完整組裝中已有良好應(yīng)用，并且已經(jīng)或?qū)⒃诒碛^遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、大型基因組組裝等領(lǐng)域發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)基因組學(xué)的研究。

單分子測(cè)序；PacBio；SMRT測(cè)序

DNA序列蘊(yùn)藏了生物絕大部分遺傳信息，是生物遺傳和進(jìn)化的基礎(chǔ)。獲得DNA序列對(duì)于闡明生命奧秘至關(guān)重要。為了測(cè)定DNA序列，1977年，Maxam和Gibert發(fā)明了化學(xué)降解法[1]。同年，Sanger發(fā)明了雙脫氧末端終止法[2]，即至今廣泛應(yīng)用的Sanger測(cè)序法。20世紀(jì)90年代，熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)用熒光代替Sanger法中的同位素，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化測(cè)序。這些技術(shù)現(xiàn)在也被稱為第一代測(cè)序技術(shù)(First-genera-tion sequencing)。應(yīng)用Sanger測(cè)序法，人們完成了人類基因組計(jì)劃。目前應(yīng)用最廣泛的第一代測(cè)序儀是ABI 3730xl測(cè)序儀，該測(cè)序儀擁有較長讀長(平均讀長700 bp)和極高準(zhǔn)確率(99.9%)，但是由于相對(duì)高昂的成本(表1)，目前主要應(yīng)用于細(xì)菌基因組測(cè)序、質(zhì)粒測(cè)序、細(xì)菌人工染色體末端測(cè)序、突變位點(diǎn)驗(yàn)證等研究，而在大型基因組組裝方面已很少應(yīng)用。

近10年，下一代測(cè)序(Next-generation sequen-cing，NGS)技術(shù)相繼出現(xiàn)并發(fā)展成熟，主要包括Roche公司的焦磷酸測(cè)序技術(shù)(454)[7]、Illumina公司的Solexa測(cè)序技術(shù)[8]和ABI公司的SOLiD測(cè)序技術(shù)[9]，這些也被稱為第二代測(cè)序技術(shù)(Second-genera-tion sequencing)。第二代測(cè)序技術(shù)以高通量、低成本為主要特點(diǎn)(表1)。其中Hiseq 2500測(cè)序儀的通量達(dá)1 Tb，測(cè)序成本為30美元/Gb，與3730xl測(cè)序儀相比，單堿基成本降低到萬分之一。第二代測(cè)序技術(shù)極大地推進(jìn)了基因組學(xué)的發(fā)展，更多物種的基因組組裝、重測(cè)序、甲基化、轉(zhuǎn)錄本、宏基因組等研究得以展開[10]。2012年11月，大型國際科研合作項(xiàng)目“千人基因組計(jì)劃”的研究人員發(fā)布了1 092個(gè)人的基因組數(shù)據(jù)[11]，該研究應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)完成了對(duì)世界上主要人群的基因組測(cè)序工作，繪制了迄今為止最詳盡、最有醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值的人類基因組遺傳多態(tài)性圖譜。另外，萬種脊椎動(dòng)物基因組計(jì)劃[12]和萬種微生物基因組計(jì)劃(http://www.gen-omics.cn/news/sh-ow_news?nid=93218)正在進(jìn)行中，這為生命科學(xué)和全球動(dòng)物保護(hù)提供前所未有的基礎(chǔ)資源。然而，讀長相對(duì)較短仍是第二代測(cè)序技術(shù)的主要瓶頸。Roche公司454 GS FLX+測(cè)序儀平均測(cè)序讀長最長，也僅為700 bp。Illumina公司Hiseq 2500測(cè)序儀的讀長只有2×125 bp(表1)。較短的測(cè)序讀長為組裝基因組帶來巨大困難；同時(shí)，由于采用了模板擴(kuò)增步驟，其在組裝高GC含量基因組時(shí)尤其受限[13]。

為了更好地發(fā)掘DNA序列信息，研究人員研發(fā)出最新一代測(cè)序方法——單分子的測(cè)序技術(shù)(Single- molecule sequencing)，也稱為第三代測(cè)序技術(shù)(Third- generation sequencing)，其共同特征是基于單分子水平的邊合成邊測(cè)序，主要包括Pacific Biosciences (PacBio)公司的單分子實(shí)時(shí)(Single-molecule real- time，SMRT)測(cè)序技術(shù)、Oxford Nanopore公司的單分子納米孔測(cè)序技術(shù)(The single-molecule nanopore DNA sequencing)、和Helicos公司的真正單分子測(cè)序技術(shù)(True single-molecule sequencing，tSMSTM)等[14]。目前，大部分第三代測(cè)序技術(shù)尚處于研發(fā)階段，只有PacBio公司的RS(Real-timesequencing)系列測(cè)序儀已經(jīng)商業(yè)化，其采用的就是SMRT測(cè)序技術(shù)。SMRT測(cè)序技術(shù)具有超長讀長，還擁有不需要模板擴(kuò)增、運(yùn)行時(shí)間較短、直接檢測(cè)表觀修飾位點(diǎn)、較高的隨機(jī)測(cè)序錯(cuò)誤等特點(diǎn)。它彌補(bǔ)了第二代測(cè)序讀長短、受GC含量影響大等局限性，已在小型基因組從頭測(cè)序和組裝中有較多應(yīng)用。本文主要介紹了PacBio RS系列測(cè)序儀使用的SMRT測(cè)序技術(shù)的原理、性能及其應(yīng)用。

表1 常用測(cè)序儀性能比較

注：#以測(cè)定96個(gè)樣品為一次運(yùn)行，其準(zhǔn)確率為經(jīng)過人工矯正后的準(zhǔn)確率；##使用SBS v4試劑盒并且同時(shí)測(cè)兩個(gè)flow cell為一次運(yùn)行；*以測(cè)定8個(gè)SMRT cell為一次運(yùn)行；**http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/solid- next-generation- sequencing/next-generation-systems/5500xl-solid.html。

1 SMRT測(cè)序原理

SMRT測(cè)序即單分子實(shí)時(shí)測(cè)序，其原理是：當(dāng)DNA模板被聚合酶捕獲后，4種不同熒光標(biāo)記的dNTP通過布朗運(yùn)動(dòng)隨機(jī)進(jìn)入檢測(cè)區(qū)域并與聚合酶結(jié)合，與模板匹配的堿基生成化學(xué)鍵的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于其他堿基停留的時(shí)間。因此統(tǒng)計(jì)熒光信號(hào)存在時(shí)間的長短，可區(qū)分匹配的堿基與游離堿基。通過統(tǒng)計(jì)4種熒光信號(hào)與時(shí)間的關(guān)系圖(http://www.paci-ficbiosciences.com/)，即可測(cè)定DNA模板序列。

SMRT測(cè)序核心技術(shù)之一是零級(jí)波導(dǎo)技術(shù)(Zero mode waveguide，ZMW)[15]。ZMW是一個(gè)直徑只有10~50 nm的孔，遠(yuǎn)小于檢測(cè)激光的波長(數(shù)百納米)。因此當(dāng)激光打在ZMW底部時(shí)，激光無法穿過，而是在ZMW底部發(fā)生衍射，只能照亮很小的區(qū)域。DNA聚合酶就被固定在這個(gè)區(qū)域。只有在這個(gè)區(qū)域內(nèi)，堿基攜帶的熒光基團(tuán)才能被激活而被檢測(cè)到，大幅地降低了背景熒光干擾。每個(gè)ZMW只固定一個(gè)DNA聚合酶，當(dāng)一個(gè)ZMW結(jié)合少于或超過一個(gè)DNA模板時(shí)，該ZMW所產(chǎn)生的測(cè)序結(jié)果在后續(xù)數(shù)據(jù)分析時(shí)被過濾掉，由此保證每個(gè)可用的ZMW都是一個(gè)單獨(dú)的DNA合成體系。15萬個(gè)ZMW聚合在一個(gè)芯片上，稱為一個(gè)SMRT Cell。PacBio RSⅡ測(cè)序儀一個(gè)流程內(nèi)可同時(shí)完成8個(gè)SMRT Cell的測(cè)序，產(chǎn)生3.2 Gb的數(shù)據(jù)(表1)。

SMRT測(cè)序的另一個(gè)核心技術(shù)是熒光基團(tuán)標(biāo)記在核苷酸3￠端磷酸上[16]。在DNA合成過程中，3￠端的磷酸鍵隨著DNA鏈的延伸被斷開，標(biāo)記物被棄去，減少了DNA合成的空間位阻，維持DNA鏈連續(xù)合成，延長了測(cè)序讀長。而第二代測(cè)序技術(shù)中熒光基團(tuán)都標(biāo)記在5￠端甲基上，在合成過程中，熒光標(biāo)記物保留在DNA鏈上，隨DNA鏈的延伸會(huì)產(chǎn)生三維空間阻力，導(dǎo)致DNA鏈延長到一定程度后出現(xiàn)錯(cuò)讀，這是限制二代測(cè)序讀長的原因之一。SMRT測(cè)序最大限度地保持了聚合酶的活性，是最接近天然狀態(tài)的聚合酶反應(yīng)體系。在實(shí)時(shí)監(jiān)控系統(tǒng)下，DNA鏈以每秒10個(gè)堿基的速度合成。從建庫到測(cè)序，整個(gè)過程在2 d內(nèi)完成。

2 SMRT測(cè)序特點(diǎn)

2.1 超長讀長

2013年4月，PacBio公司推出了PacBio RSⅡ測(cè)序儀，平均讀長達(dá)到4 600 bp，最長讀長超過 20 000 bp，每個(gè)SMRT cell 的通量為400 Mb。PacBio RSⅡ超長的讀長非常有利于基因組組裝，還可以填補(bǔ)已知基因組上的未測(cè)通區(qū)域，同時(shí)還開創(chuàng)了全新的應(yīng)用領(lǐng)域：轉(zhuǎn)錄本全長測(cè)序和全長16S基因測(cè)序等[17, 18]。轉(zhuǎn)錄本全長測(cè)序?yàn)榛蚩勺兗艚有问降淖R(shí)別、復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄分析和新基因探索提供了更有效的支持[19]。如Treutlein等[20]使用SMRT測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)軸突蛋白基因家族中數(shù)百種不同亞型，這些基因產(chǎn)物展現(xiàn)出了驚人的復(fù)雜性，并提供了軸突蛋白在促進(jìn)大腦細(xì)胞連接過程中作為識(shí)別分子具有重要作用的證據(jù)。

2.2 無需模板擴(kuò)增

基因組GC含量直接影響DNA序列的測(cè)定。第二代測(cè)序技術(shù)中文庫構(gòu)建和測(cè)序過程中都有PCR 擴(kuò)增步驟，高GC或低GC含量的基因組區(qū)域不容易被PCR擴(kuò)增，導(dǎo)致在測(cè)序過程中測(cè)序覆蓋度不足[21]。另外，在文庫構(gòu)建時(shí)需將DNA 打斷成適當(dāng)大小的片段，由于高GC含量區(qū)域不易被打斷，使得這些片段過大而在長度篩選時(shí)被舍棄[21~23]。由于SMRT測(cè)序是真正意義上的單分子測(cè)序技術(shù)，沒有PCR擴(kuò)增步驟[6, 24]，結(jié)合SMRT測(cè)序超長讀長的特點(diǎn)，可以完成長片段的高GC含量區(qū)域測(cè)序，從而幫助高GC含量基因組完成組裝。SMRT測(cè)序這一優(yōu)勢(shì)很好的應(yīng)用到極端微生物的基因組研究中[13]。同時(shí)，無需模板擴(kuò)增步驟還避免了PCR引入的錯(cuò)誤，并且只需要使用極少的熒光基團(tuán)，為今后大幅降低測(cè)序試劑成本提供了空間。

2.3 較短的運(yùn)行時(shí)間

與第二代測(cè)序技術(shù)相比，SMRT測(cè)序簡(jiǎn)化了建庫和測(cè)序步驟。一張SMRT cell從文庫制備到測(cè)序完成只需要不到1 d時(shí)間。SMRT測(cè)序的讀取速度可達(dá)每秒鐘10個(gè)堿基，實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶自身反應(yīng)速度，大幅縮短了測(cè)序周期，因此可以在酶失活之前測(cè)得更長的序列。較短的運(yùn)行時(shí)間對(duì)于應(yīng)對(duì)傳染病爆發(fā)尤為重要，在很短時(shí)間內(nèi)得到變異微生物的基因組，可以為快速和準(zhǔn)確地研究爆發(fā)起因以及治療策略提供基礎(chǔ)[25]。

2.4 直接檢測(cè)表觀修飾位點(diǎn)

SMRT測(cè)序在DNA合成時(shí)，如遇到模板上的甲基化堿基，則從dNTP與DNA聚合酶結(jié)合至釋放熒光基團(tuán)的時(shí)間顯著大于遇到非甲基化堿基所需時(shí)間，并且不同類型的修飾堿基具有不同的DNA聚合酶動(dòng)力學(xué)特征。最終根據(jù)這些動(dòng)力學(xué)特征，主要是脈沖間隔時(shí)間(Interpulse duration，IPD)長短，判斷堿基的甲基化類型[16]。因此，在較高測(cè)序覆蓋度(>15×)的前提下，SMRT測(cè)序可在完成常規(guī)測(cè)序的同時(shí)，還能獲得5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶和N6-甲基腺嘌呤的信息[26]。因?yàn)?-甲基胞嘧啶可能與5-羥甲基胞嘧啶執(zhí)行不同的生物功能[27]，所以如何簡(jiǎn)單且有效區(qū)分這兩種不同修飾堿基一直是分子生物學(xué)家關(guān)注的問題。應(yīng)用SMRT測(cè)序技術(shù)，可以較好地解決這個(gè)問題。

2.5 直接測(cè)轉(zhuǎn)錄本

如果將DNA聚合酶換成RNA反轉(zhuǎn)錄酶，SMRT測(cè)序就可以直接進(jìn)行RNA測(cè)序，無需逆轉(zhuǎn)錄[28]。這一技術(shù)目前尚處于研發(fā)階段。RNA直接測(cè)序?qū)⒔档腕w外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，還可以檢測(cè)RNA上堿基的分子修飾，這將打開一個(gè)全新的研究思路。Uemura等[29]使用該技術(shù)對(duì)核糖體中mRNA的翻譯過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)測(cè)序觀察，實(shí)時(shí)觀測(cè)到了單個(gè)核糖體如何將氨基酸串聯(lián)起來的過程。

2.6 較高但是完全隨機(jī)的測(cè)序錯(cuò)誤

SMRT測(cè)序的錯(cuò)誤率大約是15%，堿基錯(cuò)測(cè)率約1%，其他錯(cuò)誤主要是單堿基的插入和缺失(Inser-tions and deletions，INDELs)。但是當(dāng)覆蓋度超過15×?xí)r，SMRT測(cè)序過程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤通過概率算法進(jìn)行糾正后，其正確率可達(dá)99.3%[16]。通過糾錯(cuò)提高序列準(zhǔn)確性需要較高覆蓋度和大量計(jì)算機(jī)資源，這對(duì)大多數(shù)動(dòng)植物大型基因組來說較難實(shí)施，最根本的解決方法是通過技術(shù)革新提升SMRT測(cè)序本身的準(zhǔn)確率。值得注意的是，SMRT測(cè)序的錯(cuò)誤都是隨機(jī)錯(cuò)誤，而非系統(tǒng)錯(cuò)誤，系統(tǒng)錯(cuò)誤是無法通過提高測(cè)序覆蓋度矯正的[16]。

3 SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件

為了更好地應(yīng)用SMRT測(cè)序技術(shù)所產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)，近幾年報(bào)道了一些應(yīng)用這些數(shù)據(jù)的算法及軟件(表2)。從表2可以看出，這些軟件涵蓋了組裝軟件(HGAP[30]、ALLPATHS-LG[31]、AHA[32]、MIRA[33]、PacBioToCA[34])、比對(duì)軟件(BLASR[35])、糾錯(cuò)軟件(LSC[36]、PacBioToCA)、補(bǔ)“洞”軟件(AHA、PBJelly[37])、數(shù)據(jù)模擬軟件(PBSIM[38])(表2)。

由于SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)高錯(cuò)誤率的特點(diǎn)，應(yīng)用這些數(shù)據(jù)組裝基因組和補(bǔ)“洞”前需要先糾正其中的錯(cuò)誤。根據(jù)糾錯(cuò)過程是否使用第二代測(cè)序數(shù)據(jù)可將軟件分成兩類。目前，利用第二代測(cè)序數(shù)據(jù)的高準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)糾正SMRT數(shù)據(jù)的軟件有LSC、PacBio-ToCA等，這兩種方法雖然可以將SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)的錯(cuò)誤率降到小于1%，但是糾錯(cuò)的同時(shí)將第二代測(cè)序數(shù)據(jù)的系統(tǒng)錯(cuò)誤引入其中，并且需要消耗大量的計(jì)算機(jī)資源。為了避免使用第二代測(cè)序數(shù)據(jù)，Chin等[30]開發(fā)了軟件HGAP，該軟件使用SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)中的較短序列糾正較長的“種子”序列，再用糾錯(cuò)后的“種子”長序列組裝基因組。HGAP軟件使用SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)獨(dú)立地完成糾錯(cuò)和組裝，不再依賴第二代測(cè)序數(shù)據(jù)。目前，這個(gè)軟件適用于組裝小于130 M的基因組。在這些組裝軟件中，軟件AHA更適合搭建基因組草圖框架，其余幾個(gè)組裝軟件更適合混合拼接。BLASR軟件是快速比對(duì)軟件，適用于將SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到基因組，因?yàn)锽LASR比其他比對(duì)軟件更好地“容忍”這些數(shù)據(jù)中的INDEL。由于基因組上存在重復(fù)區(qū)域和高GC含量區(qū)域，目前已公布的基因組都存在“洞”，SMRT測(cè)序超長讀長和無GC偏好可以很好地完善基因組，可以應(yīng)用PBJelly等軟件填補(bǔ)基因組上的“洞”。

表2 SMRT數(shù)據(jù)的分析軟件

4 SMRT測(cè)序應(yīng)用

目前SMRT測(cè)序技術(shù)已應(yīng)用在基因組組裝、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、甲基化分析和基因組重測(cè)序等方面(表3)，尤其是在基因組組裝和甲基化研究中有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，下面將詳細(xì)介紹這兩個(gè)方面的應(yīng)用。

4.1 組裝基因組

4.1.1 大型基因組組裝

SMRT測(cè)序具有超長的讀長，對(duì)于組裝大型基因組很有幫助。但是，由于其價(jià)格較高，通常用第二代測(cè)序數(shù)據(jù)加SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)混合組裝的策略組裝大型基因組。Koren等[34]對(duì)比了第二代測(cè)序數(shù)據(jù)和混合數(shù)據(jù)組裝的虎皮鸚鵡()基因組結(jié)果：用Illumina 數(shù)據(jù)194×(包括短片段文庫和長片段文庫)組裝的conitg 數(shù)目為24 181，N50為47 838 bp；用454數(shù)據(jù)15.4×(包括短片段文庫和長片段文庫) 組裝得到contig 16 574條，N50長度為75 178 bp；用454數(shù)據(jù)15.4×加上PacBioToCA糾錯(cuò)后的SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)3.83×混合組裝，conitg數(shù)目為15 328條，N50 長度為93 069 bp。PacBio數(shù)據(jù)和454數(shù)據(jù)混合組裝與僅用454數(shù)據(jù)組裝的結(jié)果相比，conitg數(shù)目減少了1 246條，N50提升了24%。由此可見，SMRT測(cè)序超長的讀長能幫助提高大型基因組組裝效果。

4.1.2 小型基因組組裝

與混合組裝大型基因組不同，單獨(dú)使用SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)即可很好地完成小型基因組組裝。Chin等[30]比較了僅用SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)組裝和混合組裝大腸桿菌基因組(4 639 675 bp)：混合組裝用130×Illumina數(shù)據(jù)和133×SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)，采用ALLPATHS-LG軟件組裝得到1個(gè)contig，長度為4 638 970 bp；僅用99×SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)，使用HGAP軟件組裝得到2個(gè)conitg，N50為4 648 564 bp，接近基因組全長。只用SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)組裝得到與混合組裝相差無幾的結(jié)果。應(yīng)用SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)組裝小型基因組已有較多報(bào)道(表3)。

表3 SMRT測(cè)序在各方面的應(yīng)用

PacBio公司在2013年1月加入100K基因組計(jì)劃，該計(jì)劃旨在測(cè)序100 000種食源性致病菌基因組，并在同年8月已完成20種食源性病原微生物的基因組測(cè)序工作。使用SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)不但將每個(gè)基因組組裝成了單個(gè)染色體，還包含了完整的表觀遺傳學(xué)信息、完整的噬菌體以及質(zhì)粒元件信息。這對(duì)于了解菌株致病性、耐藥性及其他與生存相關(guān)的重要生物性狀非常關(guān)鍵。這些信息將有助于減少診斷和確定爆發(fā)株所需時(shí)間。目前已經(jīng)將序列和完整的表觀遺傳學(xué)信息發(fā)布在NCBI網(wǎng)站(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/186441)。

4.1.3 高/低GC含量基因組組裝

SMRT測(cè)序沒有PCR擴(kuò)增步驟，可以很好地完成高GC含量基因組的組裝。韓國極地研究所Dr. Park研究團(tuán)隊(duì)首先利用Illumina Hiseq 2000平臺(tái)對(duì)南極微生物sp. PAMC 26508的基因組進(jìn)行測(cè)序[13]。該菌株基因組GC含量高達(dá)71%，即使利用Hiseq 2000平臺(tái)進(jìn)行了200×深度的測(cè)序，仍無法獲得完整基因組。組裝時(shí)產(chǎn)生了185 個(gè)contigs，隨后使用Sanger法仍然無法有效填補(bǔ)草圖中的缺口。研究人員利用14×糾錯(cuò)過的SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)和8×454數(shù)據(jù)混合組裝，得到5個(gè)染色體conitgs和1個(gè)質(zhì)粒conitg，conitg N50達(dá)到1 430 884 bp。SMRT測(cè)序?qū)Ω逩C區(qū)域有著較其他測(cè)序儀更好的測(cè)序效果，是一項(xiàng)非常好的從頭測(cè)序和組裝高GC含量基因組的新工具。

SMRT測(cè)序也非常適用于組裝低GC含量的葉綠體基因組[50]。Ferrarini等[51]使用9111×Illumina HiSeq2000數(shù)據(jù)組裝的葉綠體基因組，只能組裝到7個(gè)contigs，有9.41%的基因組未覆蓋到。而使用320×的SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)則將葉綠體組裝成一個(gè)完整的基因組。文章中統(tǒng)計(jì)了SMRT測(cè)序所得序列與GC含量的相關(guān)性，結(jié)果顯示SMRT測(cè)序無明顯的GC偏好。

4.1.4 完善已有基因組

利用SMRT測(cè)序技術(shù)超長讀長和無GC偏好的優(yōu)勢(shì)，可對(duì)模式生物基因組草圖進(jìn)行改善。Richard Gibbs團(tuán)隊(duì)開發(fā)了高度自動(dòng)化的工具PBJelly，能夠?qū)MRT測(cè)序所得長片段與基因組草圖進(jìn)行比對(duì)，填補(bǔ)或減少草圖中的缺口，從而完善基因組草圖[37]。他們用18×SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)黑腹果蠅基因組進(jìn)行補(bǔ)洞，缺口數(shù)目從4 651個(gè)降低到311個(gè)，降低了15倍；conitg N50從64 006 bp提高到723 621 bp，提高了11倍。同時(shí)他們用6.8×SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)黑子白眉猴基因組(2.8 G)進(jìn)行升級(jí)，缺口數(shù)目從186 841個(gè)降低到66 211個(gè)，降低了2.8倍；contig N50從34 925 bp提升到128 379 bp，提升了3.7倍。由此可見，應(yīng)用SMRT測(cè)序提升基因組組裝結(jié)果，不僅可以減少缺口數(shù)目，還可以大大提高contig的長度，而且對(duì)大型基因組和小型基因組提升效果同樣明顯。

4.2 甲基化分析

SMRT測(cè)序系統(tǒng)不需要進(jìn)行重亞硫酸鹽處理等額外實(shí)驗(yàn)步驟，就能夠直接進(jìn)行表觀遺傳學(xué)分析。New England Biolabs聯(lián)合Pacific Biosciences的研究人員利用PacBio RS系統(tǒng)對(duì)6種細(xì)菌基因組進(jìn)行了重測(cè)序[52]，不僅鑒定出細(xì)菌基因組中新的胞嘧啶和腺嘌呤甲基化位點(diǎn)，還鑒定出介導(dǎo)這些表觀遺傳學(xué)標(biāo)志的甲基轉(zhuǎn)移酶。SMRT測(cè)序系統(tǒng)可以同時(shí)對(duì)堿基序列和堿基修飾兩方面測(cè)序信息進(jìn)行分析，這為表觀遺傳學(xué)及疾病基因組學(xué)開辟了新的研究思路。

5 結(jié)語與展望

近10年，DNA測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展，多種第二代和第三代測(cè)序儀相繼問世。從第一代測(cè)序到第三代測(cè)序都有各自的優(yōu)勢(shì)。Sanger測(cè)序通量低、讀長較長、準(zhǔn)確率高，對(duì)于小量測(cè)序仍是最佳選擇。高通量、低成本的第二代測(cè)序已發(fā)展成熟，在大型基因組測(cè)序和重測(cè)序中廣泛應(yīng)用。尤其是Illumina公司2014年推出的Hiseq X Ten測(cè)序儀，已實(shí)現(xiàn)1000美元完成一個(gè)人類基因組的目標(biāo)(http://www.nat-ure.com/news/is-the-1-000-genome-for-real-1.14530)。SMRT測(cè)序以超長的讀長、無GC偏好等優(yōu)勢(shì)，可以完成高GC含量、重復(fù)區(qū)域多的基因組，已廣泛應(yīng)用到細(xì)菌和真菌基因組學(xué)研究中，并將在更多研究領(lǐng)域發(fā)揮作用。在未來的一段時(shí)間里，三代測(cè)序技術(shù)將共同存在，在不同的領(lǐng)域發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，并互相補(bǔ)充[53]。鑒于第一代、第二代測(cè)序技術(shù)的一些局限性，人們?cè)絹碓疥P(guān)注單分子測(cè)序。針對(duì)已商業(yè)化的SMRT測(cè)序技術(shù)，目前已公布了一系列相關(guān)的應(yīng)用軟件，涵蓋了組裝、糾錯(cuò)、比對(duì)、數(shù)據(jù)模擬和補(bǔ)洞等常用分析。SMRT測(cè)序在細(xì)菌和真菌的基因組學(xué)以及表觀遺傳學(xué)研究中已有較多應(yīng)用，為解決生物學(xué)問題提供了新的方案。隨著SMRT測(cè)序的不斷發(fā)展，相信在不久的將來，它將為轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析、大型基因組組裝等領(lǐng)域提供有力的支持。

目前，未商用化的其他單分子測(cè)序技術(shù)有Helicos Biosciences公司的True single-molecule sequencing (tSMSTM)[54]、Oxford Nanopore Technologies公司的the single-molecule nanopore DNA sequencing (https: //nanoporetech.com/)、NABsys公司的‘Hybridization’-assisted nanopore sequencing (HANS)等 (http://www. nabsys.com/)。其中Oxford Nanopore Technologies公司將推出GridION和MinION兩款基于納米孔DNA測(cè)序技術(shù)的便攜式基因組測(cè)序儀，后者僅有U盤大小，可插入計(jì)算機(jī)的USB端口完成測(cè)序工作，價(jià)格僅900美元。

2009年9月，中國科學(xué)院北京基因組研究所與浪潮集團(tuán)共同成立了“中科院北京基因組所-浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室”(http://www.big.ac.cn/ydhz/ hzxm/200909/t20090918_2511445.html)，聯(lián)合各領(lǐng)域科研力量共同研發(fā)單分子測(cè)序技術(shù)，目前尚處于研發(fā)階段(http://www.big.ac.cn/ydhz/hzdt/200912/t20091207_ 2690938. html)。作為基因科學(xué)的戰(zhàn)略性裝備，具有國際先進(jìn)水平的第三代DNA測(cè)序儀的研制，將為中國在該領(lǐng)域取得領(lǐng)先優(yōu)勢(shì)奠定基礎(chǔ)。擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的第三代測(cè)序儀不僅將填補(bǔ)中國在DNA測(cè)序基礎(chǔ)裝備領(lǐng)域的空白、提升裝備自主化水平，同時(shí)也將使國內(nèi)生命科學(xué)研究機(jī)構(gòu)能獲得低成本、高效率的測(cè)序工具。

隨著單分子測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展及完善，預(yù)計(jì)單分子測(cè)序技術(shù)成本將逐漸下降。這將有利于展開個(gè)人基因組測(cè)序工作，基因組水平指導(dǎo)下的遺傳病診治、個(gè)人醫(yī)療和保健等工作可以更高效的進(jìn)行，人們進(jìn)入人性化醫(yī)療時(shí)代。同時(shí)也便捷了各領(lǐng)域的研究人員獲得研究領(lǐng)域的物種基因組，促進(jìn)基因組學(xué)研究的發(fā)展。

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(責(zé)任編委: 胡松年)

The principle and application of the single-molecule real-time sequencing technology

Yanhu Liu1, Lu Wang1,2, Li Yu1,2

Last decade witnessed the explosive development of the third-generation sequencing strategy, including single-molecule real-time sequencing (SMRT), true single-molecule sequencing (tSMSTM) and the single-molecule nanopore DNA sequencing. In this review, we summarize the principle, performance and application of the SMRT sequencing technology. Compared with the traditional Sanger method and the next-generation sequencing (NGS) technologies, the SMRT approach has several advantages, including long read length, high speed, PCR-free and the capability of direct detection of epigenetic modi?cations. However, the disadvantage of its low accuracy, most of which resulted from insertions and deletions, is also notable. So, the raw sequence data need to be corrected before assembly. Up to now, the SMRT is a good fit for applications in thegenomic sequencing and the high-quality assemblies of small genomes. In the future, it is expected to play an important role in epigenetics, transcriptomic sequencing, and assemblies of large genomes.

single molecule sequencing; PacBio; SMRT sequencing

2014-09-25;

2014-12-01

國家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：91131904)和中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所遺傳資源與進(jìn)化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(編號(hào)：GREKF14-04)資助

柳延虎，博士研究生，研究方向：基因組學(xué)。E-mail: liuyanhu005@163.com

于黎，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物遺傳與進(jìn)化。E-mail: yuli-1220@163.com王璐，助理研究員，研究方向：基因組學(xué)。E-mail: wanglu@ynu.edu.cn

致 謝: 感謝王國棟在文章寫作和修改過程中的指導(dǎo)和寶貴意見，感謝陳岳工程師在文章寫作過程中給予的幫助。

10.16288/j.yczz.14-323

2015-1-19 16:51:26

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150119.1651.002.html