楊 柯,張國(guó)暢,陳 洵
(天津大學(xué)化工學(xué)院,天津 300072)
近20年,生物乙醇作為最有前途的新能源之一受到廣泛關(guān)注,若能有效利用纖維素中的木糖生產(chǎn)乙醇,可至少降低25%的成本[1]。野生型釀酒酵母不利用木糖,通過導(dǎo)入畢赤酵母 XYL1、XYL2基因,構(gòu)建能利用木糖的重組釀酒酵母菌株。XYL1和XYL2基因分別編碼木糖還原酶(XR)和木糖醇脫氫酶(XDH),XR還原木糖生成木糖醇,木糖醇又被XDH氧化生成木酮糖[2],最后木酮糖被木酮糖激酶(XKS)磷酸化為5-磷酸木酮糖,進(jìn)入 PPP途徑進(jìn)行代謝。其中XR和XDH分別偏好輔酶NADPH和NAD+[3-6],導(dǎo)致輔酶不平衡和副產(chǎn)物的積累,所以木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的效率很低。
已經(jīng)有很多措施被開發(fā)來改善釀酒酵母木糖代謝性能:在重組釀酒酵母中過表達(dá)PPP途徑中的4個(gè)關(guān)鍵酶 TAL1,TKL1,RPE1,RKI1,使木糖利用速率和乙醇產(chǎn)率得到提高,說明PPP途徑關(guān)鍵酶的高活性對(duì)木糖高效發(fā)酵是必需的[7-8];通過定點(diǎn)誘變技術(shù)改變XR或XDH的輔酶偏好性來提高乙醇產(chǎn)率:XR的K270M點(diǎn)突變和K270R點(diǎn)突變,使XR對(duì)NADPH的Km值分別提高17倍和25倍,發(fā)酵結(jié)果顯示突變釀酒酵母菌株的木糖消耗速率和乙醇產(chǎn)率均提高,且木糖醇產(chǎn)率下降[9-10],也有研究發(fā)現(xiàn)增加 XDH對(duì) NADP+的親和力,同樣提高乙醇產(chǎn)率[11-12];也可以在釀酒酵母中導(dǎo)入不依賴輔酶的木糖異構(gòu)酶XI替代XR-XDH系統(tǒng)代謝木糖,能直接解決輔酶專一性不同的問題,但是XI在釀酒酵母中的活性較低,不能達(dá)到木糖的高效發(fā)酵需要[13]。
重組釀酒酵母木糖代謝過程中XR和XDH酶分別偏好輔酶NADPH和NAD+,但是由于釀酒酵母不含有轉(zhuǎn)氫酶,不能實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH和 NADH之間的直接轉(zhuǎn)化。因此,本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造性的將黑曲霉的轉(zhuǎn)氫酶基因NNT導(dǎo)入到重組釀酒酵母中,觀察轉(zhuǎn)氫酶NNT在釀酒酵母細(xì)胞中的定位和微好氧條件下對(duì)重組釀酒酵母木糖發(fā)酵的影響。
釀酒酵母在30℃培養(yǎng),用YPDA培養(yǎng)基,酵母轉(zhuǎn)化子用YSCD(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%葡萄糖)營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵在40 m L YSCX(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%木糖)的100 m L的搖瓶中進(jìn)行搖床發(fā)酵。E.coli DH5α和重組質(zhì)粒在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(根據(jù)條件可加入50 mg/L氨芐),培養(yǎng)溫度是37℃。
轉(zhuǎn)氫酶在細(xì)胞有2種形式:分別為膜定位轉(zhuǎn)氫酶和可溶性轉(zhuǎn)氫酶[1,14],本實(shí)驗(yàn)首先需確定 NNT蛋白在釀酒酵母細(xì)胞中的定位。POS5定位于線粒體中[15],mRuby是紅色熒光蛋白,將 POS5 蛋白和mRuby偶聯(lián)可確定發(fā)紅色熒光的區(qū)域位于線粒體中,因此構(gòu)建重組質(zhì)粒 Y22-POS5-mRuby-CYCT;GFP是綠色熒光蛋白,若將GFP與NNT相偶聯(lián)則發(fā)綠光的區(qū)域是NNT蛋白的表達(dá)區(qū)域,所以需構(gòu)建質(zhì)粒 Y33-NNT-GFP-CYCT。
重組質(zhì)粒Y22-POS5-mRuby-CYCT的構(gòu)建過程包含3步克隆:將本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的質(zhì)粒Dev-clonemRuby與Y33-3*ha-CYCT同時(shí)用限制性內(nèi)切酶Sal1+Xbal1雙酶切,再將前者mRuby片段的686 bp與后者6 032 bp片段相連,得到質(zhì)粒 Y33-mRuby-CYCT;然后將上述質(zhì)粒再與質(zhì)粒YCplac22用限制性內(nèi)切酶 Pst1+Hin dⅢ雙酶切,分別取片段1 106 bp和 4 838 bp,連接構(gòu)建重組質(zhì)粒 Y22-mRuby-CYCT;最后以W 303酵母菌染色體為模板,POS5-U和POS5-D為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增出的POS5基因片段與質(zhì)粒Y22-mRuby-CYCT用Sac1+Pst1雙酶切,連接構(gòu)建重組質(zhì)粒Y22-POS5-mRuby-CYCT。
重組質(zhì)粒Y33-NNT-GFP-CYCT的構(gòu)建過程:由生物公司合成NNT基因的載體質(zhì)粒PMD18-T-Simp le-NNT并與質(zhì)粒 pPGK1-noxE[16]用 Sal1+Bam H1雙酶切,2個(gè)質(zhì)粒分別取3 267 bp和6 559 bp片段連接構(gòu)建重組質(zhì)粒Y33-pPGK1-NNT,并進(jìn)行序列測(cè)定(引物為 Test-U和 Test-D);然后以 Y33-pPGK1-NNT質(zhì)粒為模板,PGK1p-U/NNT-D為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到片段 pPGK1-NNT,再與質(zhì)粒 YC-plac33-GFP-CYCT同時(shí)用 Sph1+Bam H1雙酶切,連接得到重組質(zhì)粒Y33-NNT-GFP-CYCT。
轉(zhuǎn)氫酶基因 NNT分別用啟動(dòng)子 pPGK1、pCCW 12、pHXT7過表達(dá)構(gòu)建木糖發(fā)酵的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒Y33-pPGK1-NNT的構(gòu)建如上文所述,構(gòu)建重組質(zhì)粒 Y33-pCCW 12-NNT和 Y33-pCCW12-NNT的過程如下:以菌株KAM-6X的染色體DNA為模板,分別以pCCW 12-U/pCCW 12-D和pHXT7-U/pHXT7-D為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到pCCW12和pHXT7基因片段,再分別與質(zhì)粒Y33-pPGK1-NNT用Pst1+Sal1進(jìn)行雙酶切,替換 pPGK1片段,分別得到重組質(zhì)粒 Y33-pCCW 12-NNT和 Y33-pHXT7-NNT(質(zhì)?;蛐秃鸵镄蛄幸姳?和表2)。
表1 實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒Table1 Plasm id used in this study
表2 實(shí)驗(yàn)所用的引物Table 2 Prim ers used in this study
將重組質(zhì)粒Y22-POS5-mRuby-CYCT與Y33-NNT-GFP-CYCT共同轉(zhuǎn)化到釀酒酵母W303中,長(zhǎng)出的單菌落接種到Y(jié)SCD(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%葡萄糖)液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)活化細(xì)胞,再取適量菌液轉(zhuǎn)接到上述液體培養(yǎng)基中,到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),收集適量菌體離心并將菌體用無菌水進(jìn)行清洗,然后將菌液滴在載玻片上并在蓋玻片上滴1滴香柏油,放置在熒光顯微鏡下觀察共轉(zhuǎn)化酵母菌的熒光圖像。
將重組質(zhì)粒 Y33-pPGK1-NNT、Y33-pCCW 12-NNT、Y33-pHXT7-NNT與對(duì)照空質(zhì)粒 YCPlac33轉(zhuǎn)化到重組酵母KAM-6X[18]中,得到的轉(zhuǎn)化子分別被命名為 K6X(pPGK1-NNT)、K6X(pCCW 12-NNT)、K6X(pHXT7-NNT)和 K6X(Y33)(表 3)。
表3 實(shí)驗(yàn)所用釀酒酵母菌株基因型Table 3 The genotype of recom binant S.cerevisiae
以上轉(zhuǎn)化子在40 m L YSCX(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%木糖)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行微好氧發(fā)酵。初始 OD為1左右,發(fā)酵初期,三角瓶用無菌錫箔紙封口進(jìn)行有氧發(fā)酵繁殖細(xì)胞,轉(zhuǎn)速220 r/min。菌體生長(zhǎng)到OD為10左右時(shí),將三角瓶用封口膜進(jìn)行封口且用0.5 mm針頭在膜上扎一個(gè)微孔,進(jìn)行微好氧發(fā)酵,轉(zhuǎn)速110 r/min,每24 h取樣并測(cè)定 OD600的值。將樣品離心取上清用0.2μm濾膜進(jìn)行過濾并按順序放置于樣品瓶中進(jìn)行HPLC(高效液相色譜)檢測(cè),所用色譜儀是Water Alliance 2695,流動(dòng)相為5 mM H2SO4,流速 0.6 m L/min,柱溫 45 ℃。
本實(shí)驗(yàn)中NNT基因分別用pPGK1、pCCW 12和pHXY7啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá),通過RT-PCR測(cè)定不同啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度。具體過程如下:重組釀酒酵母菌株 K6X(NNT)、K6X(pCCW 12-NNT)、K6X(pHXT7-NNT)在YSCX(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%木糖)液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液(約20個(gè) OD),然后用柱式真菌RNA out試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)提取RNA。將提取的RNA抽取部分用無菌水稀釋60~100倍,利用分光光度計(jì)測(cè)定 OD260的值,按1OD260(RNA)=40μg/m L計(jì)算,再乘以稀釋倍數(shù)可得出RNA的濃度,cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄用羅氏 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行,RT-PCR反應(yīng)用羅氏480 Real-Time PCR system,熒光染料為羅氏480 SYBR Green I,每株菌反轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的測(cè)定都要有actin對(duì)照。
將重組質(zhì)粒Y22-POS5-mRuby-CYCT與Y33-NNT-GFP-CYCT共同轉(zhuǎn)化到釀酒酵母W303中,在熒光顯微鏡(OLYMPUS BX51)下觀察共轉(zhuǎn)化酵母的熒光情況。先將熒光顯微鏡的濾光片調(diào)在B檔(激發(fā)光為藍(lán)光),觀察到酵母細(xì)胞發(fā)綠色熒光。之后保持載玻片不動(dòng),再將濾光片調(diào)到G檔(激發(fā)光為綠光),觀察酵母細(xì)胞發(fā)出紅色熒光。將兩張熒光照片擬合重疊得到圖1。顯示:偶聯(lián)有 NNT和GFP的重組釀酒酵母發(fā)出的綠色熒光沒有充斥在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中,而是和偶聯(lián)有POS5和 mRuby蛋白的重組酵母發(fā)出的紅色熒光區(qū)域重疊。由于POS5蛋白定位于粒體中[15],所以轉(zhuǎn)氫酶 NNT和 POS5蛋白一樣也定位于線粒體中。
圖1 質(zhì)粒Y22-POS5-m Ruby-CYCT與Y33-NNT-GFP-CYCT共轉(zhuǎn)化酵母的熒光圖片F(xiàn)ig.1 The fluorescence p icture of co-transform ation yeast w ith p lasm id Y22-POS5-m Ruby-CYCT and Y33-NNT-GFP-CYCT
RT-PCR測(cè)定結(jié)果顯示如圖2。在木糖發(fā)酵條件下,表達(dá)NNT基因的啟動(dòng)子pPGK1的表達(dá)強(qiáng)度最低,pCCW 12啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度最高,pHXT7表達(dá)強(qiáng)度稍低于pCCW12。
圖2 表達(dá)NNT基因的啟動(dòng)子pPGK 1、pCCW 12和pHXT7在木糖中的強(qiáng)度Fig.2 The transcriptional level of prom oters expressing NNT gene in m edium containing xylose
圖3 重組釀酒酵母的木糖發(fā)酵Fig.3 Xylose ferm en tation of recom binant S.cerevisiae
重組轉(zhuǎn)化子 K6X(pPGK1-NNT),K6X(pCCW 12-NNT),K6X(pHXT7-NNT)和對(duì)照 K6X(Y33)的微好氧木糖發(fā)酵結(jié)果如下:菌株K6X(pCCW12-NNT)和K6X(pHXT7-NNT)與對(duì)照相比木糖消耗速率和生長(zhǎng)速率都降低[圖3a)和圖3e)],乙醇產(chǎn)量也降低[圖3c)],但是木糖醇和甘油的產(chǎn)量有明顯下降[圖3b)和圖3d)];表 4顯示 K6X(pCCW12-NNT)和 K6X(pHXT7-NNT)的木糖醇產(chǎn)率比對(duì)照分別降低86.3%和49.3%,乙醇產(chǎn)率分別提高16.7%和12.7%。
表4 木糖發(fā)酵的乙醇終濃度和代謝產(chǎn)率Table 4 Final ethanol concentration and results of xylose ferm en tation
重組轉(zhuǎn)化子K6X(pPGK1-NNT)的木糖消耗速率、生長(zhǎng)速率和乙醇產(chǎn)量與對(duì)照相似,木糖醇沒有明顯降低,但是甘油產(chǎn)量明顯下降其產(chǎn)率降低了27.58%,同時(shí)乙醇產(chǎn)率提高6.6%,乙醇終濃度達(dá)到了13.82 g/L。
以上發(fā)酵結(jié)果顯示:1)NNT基因?qū)胫亟M釀酒酵母中使甘油的產(chǎn)量下降,說明在轉(zhuǎn)氫酶NNT的作用下NADH的產(chǎn)生降低,而甘油的形成需要消耗NADH因此甘油產(chǎn)量下降[20];2)在 K6X(pCCW 12-NNT)和K6X(pHXT7-NNT)中木糖醇產(chǎn)量和產(chǎn)率都有明顯下降,說明NNT基因在酵母細(xì)胞內(nèi)催化輔酶NADH和NADPH之間的相互轉(zhuǎn)化,改善了木糖代謝的輔酶不平衡,降低了副產(chǎn)物木糖醇的產(chǎn)量[21],但是在菌株 K6X(pPGK1-NNT)中木糖醇降低并不明顯,這可能是由于啟動(dòng)子pPGK1的表達(dá)強(qiáng)度過低;3)表達(dá)有NNT基因的重組釀酒酵母,雖然乙醇產(chǎn)量沒有明顯提高但是乙醇產(chǎn)率提高,副產(chǎn)物木糖醇和甘油的降低使更多的碳源流向乙醇,提高了乙醇轉(zhuǎn)化率。
為了實(shí)現(xiàn)木碳代謝過程中輔酶NADH和NADPH之間的相互轉(zhuǎn)化,本實(shí)驗(yàn)在重組釀酒酵母中創(chuàng)造性的導(dǎo)入了黑曲霉的轉(zhuǎn)氫酶基因NNT。首先,通過共轉(zhuǎn)化釀酒酵母的熒光實(shí)驗(yàn)得到:NNT蛋白和POS5一樣定位于線粒體中。然后,NNT基因分別用啟動(dòng)子 pPGK1、pCCW 12和 pHXT7來表達(dá),其表達(dá)強(qiáng)度為:pCCW12>pHXT7》pPGK1;最后在微好氧的木糖發(fā)酵結(jié)果顯示:黑曲霉NNT基因的導(dǎo)入使木糖發(fā)酵的甘油和木糖醇產(chǎn)量降低,同時(shí)乙醇產(chǎn)率提高;尤其在使用強(qiáng)啟動(dòng)子pCCW 12和pHXT7過表達(dá)NNT基因的重組酵母菌株中,木糖醇產(chǎn)率明顯降低,說明了NNT基因高效表達(dá)能改善木糖代謝的輔酶不平衡;同時(shí)甘油產(chǎn)生的減少也說明在NNT基因作用下輔酶NADH的產(chǎn)生降低。
由于轉(zhuǎn)氫酶存在兩種形式:一種是膜定位的轉(zhuǎn)氫酶,需消耗 ATP,催化從 NADH到 NADPH的反應(yīng)[22-23];另一種是可溶性轉(zhuǎn)氫酶,催化方向與上述反應(yīng)相反同時(shí)不需能量[1,14]。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè):NNT可能膜定位轉(zhuǎn)氫酶,催化從NADH到NADPH的反應(yīng),依賴ATP,其反應(yīng)機(jī)理可能是質(zhì)子泵驅(qū)動(dòng)的類型(AB型)[14,24]。但是表達(dá)有 NNT基因的重組酵母菌株的木糖消耗速率和生長(zhǎng)速率均降低,其原因可能是:轉(zhuǎn)氫酶NNT在酵母細(xì)胞內(nèi)的活性比較低和NADH轉(zhuǎn)化生成NADPH導(dǎo)致了NAD+的缺乏,從而限制了木糖醇脫氫酶XDH催化的反應(yīng)。
在未來研究中,我們希望能進(jìn)一步了解轉(zhuǎn)氫酶NNT在重組酵母細(xì)胞內(nèi)的代謝機(jī)理,還可以利用蛋白工程方法提高 NNT的酶活或者適當(dāng)調(diào)整 XR、XDH和NNT的酶活比例,來提高釀酒酵母的木糖代謝能力和生長(zhǎng)速率。
[1]侯進(jìn),沈煜,鮑曉明,等.釀酒酵母木糖代謝工程輔酶工程的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志,2006,26(2):89-94 Hou Jin,Shen Yu,Bao Xiaoming,et al.Research progress in cofactor engineering of xylose metabolism in recombinant Saccharomyces cerevisiae[J].China Biotechnolgy,2006,26(2):89-94(in Chinese)
[2]Jin Y S,Lee T H,Choi Y D,et al.Conversion of xylose to ethanol by recombinant Saccharomyces cerevisiae containing genes for xylose reductase and xylitol dehydrogenase from Pichia stipitis[J].M icorbiol Biotechnol,2000,10:564-567
[3]Chiang C,Knight S G.A new pathway of pentose metabolism[J].Biochem Biophys Res Commun,1960,3:554-559
[4]Rizzi M,Harwart K,Erlemann P,et al.Purification and properties of the NAD+-xylitol-dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1989,67(1):20-24
[5]Verduyn C,Vankleef R,F(xiàn)rank J,et al.Properties of the NAD(P)H-dependent xylose reductase from the xylose-fermenting yeast Pichia stipitis[J].Biochem J,1985,226(3):669-677
[6]Jeffries T W.Engineering yeasts for xylose metabolism[J].Curr Opin Biotechnol,2006,17:320-326
[7]Karhumaa K,Hahn-Hagerdal B,Grauslund G,et al.Investigation of limiting metabolic steps in the utilization of xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae using metabolic engineering[J].Yeast,2005,22(5):359-368
[8]Kuyper M,Toirkens M J,Diderich J A,et al.Evolutionary engineering of mixed-sugar utilization by a xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae strain [J].FEMS Yeast Res,2005,5(10):925-934
[9]Bengtsson O,Hahn-H?gerdal B,Gorwa-Grauslund M F.Xylose reductase from Pichia stipitis with altered coenzyme preference improves ethanolic xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnology for Biofuels,2009,2(18):50-55
[10]Jeppsson M,Bengtsson O,F(xiàn)ranke K,et al.The expression of a Pichia stipitis xylose reductase mutant with higher KM for NADPH increases ethanol production from xylose in recombinant Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnol Bioeng,2006,93(4):665-673
[11]Watanabe S,Saleh A A,Pack S P,et al.Ethanol production from xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing protein engineered NADP+-dependent xylitol dehydrogenase[J].J Biotechnol,2007,130(3):316-319
[12]Matsushika A,Watanabe S,Kodaki T,et al.Expression of protein engineered NADP+-dependent xylitol dehydrogenase increases ethanol production from xylose in recombinant Saccharomyces cerevisiae[J].Appl M icrobiol Biotechnol,2008,81(2):243-255
[13]Kuyper M,Hartog M M,Toirkens M J,et al.Metabolic engineering of a xylose-isomerase-expressing Saccharomyces cerevisiae strain for rapid anaerobic xylose fermentation[J].FEMS Yeast Res,2005,5(4/5):399-409
[14]Jackson B,Peake S J,White SA.Structure and mechanism of proton-translocating transhydrogenase[J].FEBS Lett,1999,464:1-8
[15]Iwahashi Y,Hitoshio A,Tagima N,et al.Characterization of NADH kinase from Saccharomyces cerevisiae[J].J Biochem,1989,105(4):588-593
[16]Zhang G,Liu J,Ding W,et al.Decreased xylitol formation during xylose fermentation in Saccharomyces cerevisiae due to overexpression of water-forming NADH oxidase[J].Appl Environ Microbiol,2012,78(4):1 081-1 086
[17]Gietz R D,Akio S.New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitromutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites[J].Gene,1988,74(2):527-534
[18]張國(guó)暢.利用代謝工程、輔酶工程及酶工程構(gòu)建重組釀酒酵母木糖利用菌株以生產(chǎn)乙醇的研究[D].天津:天津大學(xué),2012 Zhang Guochang.Metabolic engineering,cofactor engineering and enzymatic engineering for construction of recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strains to produce ethanol[D].Tianjin:Tianjin University,2012(in Chinese)
[19]Thomas B J,Rothstein R.The genetic control of directrepeat recombination in Saccharomyces:The effect of rad52 and rad1 on m itotic recombination at GAL10,a transcriptionally regulated gene[J].Genetics,1989,123(4):725-738
[20]van Dijken J P,Scheffers W A.Redox balances in the metabolism of sugars by yeasts[J].FEMS M icrobiol Lett,1986,32:199-224
[21]Verho R,Londesborough J,Penttil?M,et al.Engineering redox cofactor regeneration for improved pentose fermentation in Saccharomyces cerevisiae[J].App l Environ M icrobiol,2003,69(10):5 892-5 897
[22]Pedersen A,Karlsson G B,Rydstrom J.Proton-Translocating transhydrogenase:An update of unsolved and controversial issues[J].J Bioenerg Biomembr,2008,40(5):463-473
[23]Bizouarn T,A lthage M,Pedersen A,et al.The organization of the membrane domain and its interaction with the NADP(H)-binding site in proton-translocating transhydrogenase from E.Coli[J].Biochim Biophys Acta,2002,1555(1/3):122-127
[24]Mather O C,Singh A,van Boxel G I,et al.Active-Site conformational changes associated with hydride transfer in proton-translocating transhydrogenase[J].Biochemistry,2004,43(34):10 952-10 964