大黃中游離蒽醌的提取、分離的實(shí)訓(xùn)操作※

王 英 萬 紅 彭志芬

（江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，撫州 344000）

大黃中游離蒽醌的提取、分離的實(shí)訓(xùn)操作※

王 英 萬 紅 彭志芬

（江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，撫州 344000）

大黃是我國的常用中藥之一，含有多種蒽醌化合物，是具有代表性的蒽醌類衍生物，在中藥化學(xué)、天然藥物化學(xué)課程中都有大黃中游離蒽醌的提取、分離與檢識(shí)的實(shí)驗(yàn)課程，在操作中運(yùn)用到回流、連續(xù)回流、PH梯度法和色譜法。目的 通過對(duì)大黃中游離蒽醌的提取、分離的實(shí)訓(xùn)操作，使學(xué)生能夠輕松掌握回流、連續(xù)回流、PH梯度法的原理及操作技術(shù)，鑒定方法和運(yùn)用色譜法進(jìn)行蒽醌類成分的鑒別。

大黃；游離蒽醌；中藥化學(xué)

大黃是我國的四大中藥之一，名火參、金木、破門、綿紋等，來源于蓼科植物掌葉大黃、藥用大黃或唐特大黃的根及根莖。性寒，味苦，具有攻積導(dǎo)滯、瀉火涼血、活血化瘀、利膽退黃的功效，內(nèi)服治療腸胃積滯、大便不通，外用治療燒傷，并有止血作用，近來又將大黃中的游離蒽醌用作抗菌消炎藥，其藥性峻烈，素有“將軍”之稱，是具有代表性的蒽醌類衍生物，在中藥化學(xué)、天然藥物化學(xué)課程中都有大黃中游離蒽醌的提取分離與檢識(shí)的實(shí)驗(yàn)，如何上好本實(shí)驗(yàn)課，我們認(rèn)為如下做，有利于學(xué)生掌握操作。

1 講解實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?/h2>

掌握回流、連續(xù)回流、PH梯度法的原理及操作技術(shù)。掌握蒽醌類化合物鑒定方法。能夠運(yùn)用色譜法進(jìn)行蒽醌類成分的鑒別。

2 講解實(shí)驗(yàn)原理

大黃的主要成分為為蒽醌化合物，含量約為3%～5%，大部分與葡萄糖結(jié)合苷，游離苷元主要有大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酚，結(jié)構(gòu)如圖1：

大黃中的羥基蒽醌苷經(jīng)酸水解成游離蒽醌苷元，苷元可溶于氯仿而被提取，再根據(jù)各羥基蒽醌的酸度差異，可用堿性強(qiáng)弱不同的溶液進(jìn)行梯度萃取分離。其中，大黃酸具有羧基，酸性最強(qiáng)；大黃素具有β-酚羥基，酸性第二；蘆薈大黃素連有羥甲基，酸性第三；大黃素甲醚和和大黃酚的酸性最弱。

3 實(shí)驗(yàn)所需儀器和試劑

電熱套、圓底燒瓶、索氏提取器、濾紙、薄層板、噴瓶、20%硫酸、氯仿、濃鹽酸、分液漏斗、檸檬酸-磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、石油醚、CMC-Na、苯、乙酸乙酯、甲醇 氨、KOH

4 講解實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與指導(dǎo)操作

本實(shí)驗(yàn)講解的要點(diǎn)：pH梯度萃取的原理及注意事項(xiàng)。設(shè)計(jì)萃取分離方案的程序與方法。

4.1 游離蒽醌的提取 酸水解：稱取大黃粗粉50 g，置500 mL圓底燒瓶中加20%H2SO4水溶液100 mL，在水浴上加熱回流4小時(shí)，放冷，抽濾，濾餅用水洗至近中性（pH約為6），于70℃干燥后，研碎，裝入濾紙筒內(nèi)，置索氏提取器中，加入氯仿200 mL回流提取3～4小時(shí)，得游離蒽醌的氯仿提取液。

注意事項(xiàng)：①大黃中的蒽醌類成分大部分與糖結(jié)合，以蒽醌的形式存在于植物組織中。所以要用酸水解使其生成苷元。蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有機(jī)溶劑，用氯仿或苯時(shí)，注意有毒，應(yīng)在通風(fēng)櫥中操作，嚴(yán)防中毒；②所得的氯仿液中如帶有酸水液，應(yīng)該用分液漏斗分出棄去，并用蒸餾水回洗一次除去酸性以免影響梯度萃取。氯仿提取液放置中如有沉淀析出，可濾取之，該沉淀多為大黃素，余液進(jìn)行下一步分離試驗(yàn)用。4.2 PH梯度萃取分離

4.2.1 大黃酸的分離 將氯仿提取液加入250 mL分液漏斗中（使用前先檢漏），一次性加入PH8緩沖溶液70 mL（約為氯仿溶液的1/3量)，振搖萃取，靜置，充分分層后，分取緩沖溶液于燒杯中，保留氯仿溶液。緩沖液用濃鹽酸酸化至PH 2～3左右，析出大黃酸沉淀。（注意：加酸時(shí)應(yīng)緩慢加入，以防酸液溢出）。抽濾后，沉淀用蒸餾水洗至近中性，低溫干燥，再用冰醋酸重結(jié)晶，得大黃酸黃色針晶，刮下顆粒并稱重。

4.2.2 大黃素的分離 分離大黃酸的氯仿溶液，再一次性加入PH9.9緩沖溶液100 mL（約為氯仿溶液的1/2量)，振搖萃取，靜置，充分分層后，分取緩沖溶液于燒杯中，保留氯仿溶液分取緩沖溶液于燒杯中，保留氯仿溶液。緩沖液用濃鹽酸酸化至PH 2～3左右，析出大黃素沉淀。（酸化時(shí)注意操作同前）。靜置，過濾，沉淀用蒸餾水洗至近中性，低溫干燥，再用吡啶重結(jié)晶，得大黃色針晶，刮下顆粒并稱重。

4.2.3 蘆薈大黃素的分離 分離大黃素的氯仿溶液，再一次性加入5%Na2CO3-5%NaOH（9∶1） 堿性溶液200mL（約為氯仿溶液的1倍)，振搖萃取，靜置充分分層，分取堿性溶液于燒杯中，保留氯仿溶液。堿液用濃鹽酸酸化至PH2-3左右，析出蘆薈大黃素（酸化時(shí)注意操作同前）。靜置，過濾，沉淀用蒸餾水洗至近中性，低溫干燥，用乙酸乙酯重結(jié)晶，得橙色針晶的蘆薈大黃素純品。

4.2.4 大黃酚和大黃素甲醚的分離 分離蘆薈大黃素的氯仿溶液，再以2%NaOH水溶液振搖萃取至堿水層近無色為止（3～4次)，合并NaOH萃取液于燒杯中，用濃鹽酸酸化至PH2-3左右，析出沉淀，靜置。過濾，沉淀用蒸餾水洗至近中性，低溫干燥，取干燥后的沉淀溶于小體積石油醚中，作為柱色譜的樣品溶液。

裝柱：色譜柱用鐵架臺(tái)固定后，將一小團(tuán)脫脂棉放于柱底部使形成一個(gè)較松的墊層，關(guān)閉活塞，倒入少量洗脫劑。取纖維素粉8 g，加入已裝有水飽和石油醚（60～90℃)，待纖維素粉完全沉降后，打開色譜柱下端的活塞，將色譜柱內(nèi)液體放至與柱床平齊，關(guān)閉活塞。

樣品上柱：將樣品溶液用移液管小心加入到色譜柱柱床的頂端。

洗脫：用水飽和的石油醚（沸程60～90℃)洗脫，分段收集，約10 ml為一份，分別濃縮，經(jīng)紙色譜檢查，相同組分合并，分別得到大黃酚和大黃素甲醚。

4.3 樣品鑒定

4.3.1 化學(xué)檢識(shí) 分別取總蒽醌提取物少許，置燒杯中，用乙醚溶解，做如下反應(yīng)。①堿液試驗(yàn)：取試液1 ml，加20%NaOH數(shù)滴，振搖放置分層后，觀察顏色。溶液呈紅色。②醋酸鎂反應(yīng)：取試樣1ml，加醋酸鎂試劑數(shù)滴，觀察現(xiàn)象。溶液產(chǎn)生橙、紅、紫等顏色。

4.3.2 薄層鑒定 吸附劑：CMC-Na薄層板。

樣品：各蒽醌成分的1%氯仿溶液。

對(duì)照品：1%大黃酸標(biāo)準(zhǔn)品氯仿溶液、1%大黃素標(biāo)準(zhǔn)品氯仿溶液、1%蘆薈大黃素標(biāo)準(zhǔn)品氯仿溶液。

展開劑：苯-乙酸乙酯 （8∶2） ;苯-甲醇 （8∶1）。

顯色：（1） 氨熏后觀察。（2） 5%KOH噴霧后觀察。

5 講解本實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

①大黃中的蒽醌類化學(xué)物的種類、含量與大黃的品種、采集季節(jié)、炮制方法及貯存時(shí)間均有關(guān)系，實(shí)驗(yàn)用藥材應(yīng)注意。②游離蒽醌的提取要控制溫度，不宜太高，回流不宜太劇烈，溶液保持微沸，防止藥渣炭化，加熱時(shí)要不斷攪拌。③pH梯度萃取分離時(shí)，以保證提取充分，可以用薄層色譜作監(jiān)測(cè)。④注意堿液濃度及萃取時(shí)的靜置時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。⑤萃取用PH8緩沖為檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液；PH9.9緩沖為碳酸氫鈉-碳酸鈉緩沖液。緩沖液的配制和堿液的配制要準(zhǔn)確，配制好的緩沖液要測(cè)PH值。嚴(yán)格注意檢查。⑥用各緩沖液進(jìn)行萃取時(shí)，采用一次性加入的方法，實(shí)驗(yàn)證明，如將緩沖液分次萃取分離效果不理想。⑦分離萃取時(shí)一定注意乳化層的分出，不要混入，并且每步最好用新鮮CHCl3，回洗堿水液。

6 講解實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求

①記錄大黃總蒽醌的提取方法及總蒽醌的分離程序（包括溶劑用量）。②總蒽醌的顯色鑒別結(jié)果。③記錄大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素的精制方法及薄層色譜鑒別結(jié)果。

7 布置思考題

①簡述大黃中5種游離羥基蒽醌化合物的酸性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系。②pH梯度萃取法的原理是什么？如何利用該方法分離大黃中的5種游離羥基蒽醌化合物？

到此，整個(gè)實(shí)驗(yàn)完成。通過以上的講解與訓(xùn)練，我們認(rèn)為學(xué)生能夠及時(shí)地掌握和消化本章節(jié)的內(nèi)容。參考文獻(xiàn)

[1]吳劍峰，王寧.天然藥物化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：230.

[2]吳立軍.天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：210.

[3]徐選明，劉新.大黃中大黃素提取工藝的優(yōu)化[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11，5.

[4]朱慶玲，李瑞和.大黃中大黃素的提取工藝研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17，3.

Practical Operation on the Extraction and Separation of the free Anthraquinones in Rhubarb Root and Rhizome

WANGYing,WANHong,PENGZhifeng
(Department of Pharmacy,JiangxiCollegeof TraditionalChineseMedicine,JiangxiProvince,Fuzhou344000,China)

Rhubarb root and rhizome is one of the commonly used Chinese medicines in our country,which contains a variety of anthraquinone compounds,and is a representative anthraquinone derivative.In Chemistry of Chinese Materia Medica and Natural Medicine Chemistry,there are experiment courses on the extraction,separation and detection of the free anthraquinones in rhubarb root and rhizome.In the operation,reflux,continuous reflux,PH gradient method and chromatography were used.Through the practical operation on the extraction and separation of the free anthraquinones in rhubarb root and rhizome,students can easily master the principle and operation technology of reflux,continuous reflux,PH gradient method,and identification method and the identification of the constituents of the anthraquinone by using chromatography.

rhubarb root and rhizome;free anthraquinones;Chemistry of Chinese Materia Medica

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.22.079

1672-2779（2015）-22-0148-02

江西省教育廳教改課題（No：JXJG-12-28-7）

2015-08-26）