電針對繼發(fā)性脊髓損傷后大鼠神經(jīng)元自噬及相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ和bcl－2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白3表達的影響

楊 波 隋汝波 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

電針對繼發(fā)性脊髓損傷后大鼠神經(jīng)元自噬及相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ和bcl－2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白3表達的影響

楊 波 隋汝波 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

目的 觀察電針治療對大鼠繼發(fā)性脊髓損傷(SCI)后神經(jīng)元自噬及相關(guān)蛋白表達的影響。方法 健康SD大鼠隨機分為對照組、模型組、西藥組(甲潑尼龍治療)及電針組(電針大椎、命門穴治療)4組;除對照組外，其他3組均采用改良的Allen打擊裝置(50 g/cm)復(fù)制大鼠T10～11中度SCI模型。分別于SCI后6 h、1 d、7 d取損傷局部脊髓組織，經(jīng)透射電子顯微鏡及Western印跡法，觀察各組SCI后神經(jīng)元自噬的病理變化及輕鏈(LC)3Ⅱ、bcl－2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白(BNIP)3的表達。結(jié)果 ①SCI后1 d脊髓組織中LC3Ⅱ、BNIP3表達明顯升高(P＜0.01);電針組和西藥組SCI后脊髓組織中LC3Ⅱ、BNIP3的表達顯著降低，與模型組差異顯著(P＜0.01);西藥組與電針組差異不顯著(P＞0.05)。②在透射電鏡觀察下，對照組脊髓組織神經(jīng)元細(xì)胞核膜完整，胞質(zhì)中線粒體形態(tài)分布及數(shù)目正常，未發(fā)現(xiàn)自噬小體，溶酶體數(shù)目也未見增多;模型組脊髓組織可見線粒體腫脹明顯、空泡化，溶酶體數(shù)量增多，細(xì)胞核形不規(guī)則，可發(fā)現(xiàn)自噬小體;西藥組和電針組可見脊髓組織神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，線粒體也略腫脹，核形規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)欠均勻，溶酶體數(shù)目未見明顯增多。結(jié)論 電針可降低SCI大鼠脊髓組織中LC3Ⅱ和BNIP3的表達，抑制細(xì)胞自噬，減緩脊髓損傷后的病理損害，其作用與甲潑尼龍相仿。

脊髓損傷;電針;自噬;輕鏈(LC)3Ⅱ;bcl－2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白(BNIP)3

脊髓損傷(SCI)大多源于交通事故、運動意外和暴力〔1，2〕。目前皮質(zhì)類固醇激素類藥物是唯一被美國聯(lián)邦食品藥品管理局批準(zhǔn)治療SCI的藥物〔3〕，并取得了一定的臨床療效，但大劑量或長期使用會引起諸多不良反應(yīng)〔4〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，電針可以阻止或減輕SCI后的繼發(fā)性損害，促進脊髓的修復(fù)和再生〔5，6〕。繼發(fā)性SCI的主要機制為凋亡和自噬。電針對SCI后脊髓細(xì)胞凋亡的研究已有眾多的報道〔7，8〕，但是到目前尚無關(guān)于電針對SCI后脊髓細(xì)胞自噬影響的研究。本實驗探討電針干預(yù)對繼發(fā)性SCI大鼠神經(jīng)細(xì)胞自噬及自噬相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 分組及動物模型復(fù)制〔9〕選用成年SD大鼠40只，體重250～300 g，雌雄兼有。大鼠給予自由飲水和進食，白天和夜晚各12 h的睡眠、活動時間。隨機分為4組，每組10只，為對照組、模型組、西藥組(甲潑尼龍治療)和電針組(電針大椎、命門穴治療)。除對照組外，其他3組采用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔麻醉，俯臥位固定于自制的弓形手術(shù)臺上，以微型咬骨鉗咬除T9～11棘突和椎板，暴露脊髓，但不損傷硬脊膜。采用自制的Allen改良式打擊裝置，高度為5 cm，致傷量為50 g/cm，造成T10～11節(jié)段急性SCI(此致傷量可造成大鼠的不完全性截癱，屬中等程度損傷)。雙下肢及背部肌肉瞬時收縮，硬脊膜下出血，鼠尾持續(xù)劇烈擺動數(shù)秒，麻醉醒后雙下肢表現(xiàn)為不完全癱瘓，提示造模成功。

1.2 治療模型制作 電針組是在造模大鼠蘇醒后先行聯(lián)合行為評分(CBS)，再選取大椎(第7頸椎棘突下，向下斜刺)、命門(第2腰椎棘突下，向上斜刺)進行針刺治療，進針約0.5～0.7 cm。使用韓氏LH-202H型穴位神經(jīng)刺激儀，大椎穴接陰極，命門穴接陽極，持續(xù)脈沖電流，頻率2 Hz，治療時間20 min，輸出強度在剛開始時以背部肌肉出現(xiàn)輕微抽動為度，待其適應(yīng)后則以雙下肢癱瘓肌肉出現(xiàn)有節(jié)律的收縮為度。電針組每天同一時間重復(fù)治療一次。西藥組于造模后以30 mg/kg體重的甲潑尼龍尾靜脈注射。第2天同一時間以5.4 mg/kg體重的甲潑尼龍尾靜脈重復(fù)注射1次，之后再不給藥。對照組和模型組不做任何治療，但要在同一時間均抓取一次，以保證應(yīng)激條件相同。

1.3 透射電鏡觀察 各組成模后7 d腹腔注射4%水合氯醛(4 ml/kg)麻醉后，自左心室灌注生理鹽水，4%多聚甲醛-5%戊二醛灌注固定，損傷脊髓后角取約1 mm3的組織，磷酸緩沖液漂洗，1%餓酸后固定1 h，酒精、丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，甲苯胺藍(lán)染色后定位，超薄切片(60 nm)，醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色，透射電鏡下觀測。

1.4 Western印跡檢測 麻醉方法同上，在不同時間點，迅速取出長約10 mm包括損傷區(qū)域的脊髓組織，組織蛋白提取試劑提取脊髓總蛋白，二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白濃度，相同質(zhì)量的樣品(40 μg)，4～12%NuPAGE凝膠恒壓分離，濕轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉液室溫封閉1 h，兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3多克隆抗體(1∶500)，兔抗基因bcl-2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白(BNIP)3多克隆抗體(1∶200)和小鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶500)4℃孵育過夜，分別加入HRP標(biāo)記山羊抗兔和HRP標(biāo)記山羊抗小鼠的二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光液顯影。Western印跡結(jié)果用掃描分析軟件系統(tǒng)(Labworks Analysis Software，美國)測定各條帶的積分灰度值，以目的蛋白與β-actin蛋白產(chǎn)物條帶灰度值之比作為其蛋白水平的相對量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡觀測神經(jīng)元自噬 對照組脊髓組織神經(jīng)元細(xì)胞核膜完整，胞質(zhì)中線粒體形態(tài)正常(箭頭所示)，未發(fā)現(xiàn)自噬小體，溶酶體數(shù)目也未見增多。模型組可見線粒體腫脹明顯、空泡化，溶酶體數(shù)量增多，細(xì)胞核形不規(guī)則，可發(fā)現(xiàn)自噬小體。西藥組和電針組可見脊髓組織神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，線粒體略腫脹，核形規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)欠均勻，游離核糖體及溶酶體數(shù)目未見明顯增多。見圖1。

圖1 各組7 d后神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)

2.2 Western印跡檢測LC3Ⅱ的表達 LC3Ⅱ在對照組幾乎不表達，在SCI后6 h，1、7 d 3個時間段，模型組脊髓組織中LC3Ⅱ表達均升高，與對照組差異顯著(P＜0.01)，并且在損傷后1 d達到高峰;電針組與西藥組均可降低LC3Ⅱ表達水平，與模型組差異顯著(P＜0.01)。見圖2、表1。

2.3 Western印跡檢測BNIP3的表達 BNIP3在SCI后6 h明顯升高，1 d后達到高峰(P＜0.01)，7 d后又下降至對照組水平，電針組與西藥組均可降低LC3-Ⅱ表達水平，與模型組差異顯著(P＜0.01)。見圖2、表1。

圖2 各組LC3Ⅱ、BNIP3表達Western印跡檢測結(jié)果

表1 半定量分析不同損傷時間點LC3Ⅱ、BNIP3表達(n=10，±s)

表1 半定量分析不同損傷時間點LC3Ⅱ、BNIP3表達(n=10，±s)

與對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

BNIP3組別 LC3Ⅱ6 h 1 d 7 d 6 h 1 d 7 d對照組 0.046 4±0.010 2 0.048 7±0.015 2 0.042 7±0.016 20.077 3±0.012 5 0.068 9±0.017 2 0.062 7±0.018 4模型組 0.146 6±0.026 41) 0.512 6±0.056 21) 0.365 5±0.023 21) 0.275 4±0.043 41) 0.441 7±0.065 81) 0.285 8±0.053 51)西藥組 0.086 9±0.011 42) 0.079 8±0.009 22) 0.295 6±0.008 7 0.157 8±0.012 52) 0.179 7±0.009 52) 0.096 7±0.011 62)電針組 0.157 8±0.012 2 0.144 7±0.013 42) 0.123 7±0.009 62) 0.157 8±0.012 82) 0.144 7±0.013 62) 0.083 7±0.010 32)

3 討論

SCI后的病理損害分為原發(fā)性SCI和繼發(fā)性SCI〔10〕。前者是在受傷瞬間暴力直接或間接作用于脊髓所造成的傷害，屬不可逆損傷;后者則是由前者引發(fā)的一系列神經(jīng)病理變化(如脊髓缺血、缺氧、水腫及神經(jīng)細(xì)胞變性壞死等)，采用治療手段可影響它的發(fā)生和發(fā)展，屬可控性損傷，所以目前研究的焦點主要是繼發(fā)性 SCI〔11〕。

神經(jīng)細(xì)胞自噬是繼發(fā)性SCI的重要組成部分。很多研究也證實，繼發(fā)性SCI廣泛存在著神經(jīng)細(xì)胞自噬現(xiàn)象〔11〕。自噬發(fā)生的過程是一系列自噬性結(jié)構(gòu)逐漸演變的過程，自噬被誘導(dǎo)上調(diào)后，在細(xì)胞內(nèi)形成隔離膜，并與需降解的胞質(zhì)成分集結(jié)在一起，然后隔離膜延伸并包裹封閉胞質(zhì)成分形成一個雙層膜的結(jié)構(gòu)，即自噬小體，自噬小體與溶酶體直接融合形成自噬溶酶體，最終在溶酶體酶的作用下被降解利用〔12〕。透射電鏡是觀察自噬現(xiàn)象的最直接、最經(jīng)典的方法，而電鏡檢測自噬主要目的是辨認(rèn)自噬小體的結(jié)構(gòu)〔13〕。

Kanno等〔13〕也在SCI后3 d時使用透射電鏡觀測到了自噬小體，這與本實驗結(jié)果基本一致，但Kanno等〔13〕的電鏡圖片沒有區(qū)分損傷細(xì)胞的類型以及基本結(jié)構(gòu)，而本文圖片重點觀察了細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。本文結(jié)果表明，電針組和西藥組的鏡下病變明顯輕于模型組，并且恢復(fù)較好，兩組均可減輕SCI后脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞的自噬。

自噬過程由一系列自噬相關(guān)蛋白介導(dǎo)完成。LC3是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，當(dāng)未發(fā)生自噬時，細(xì)胞內(nèi)合成的LC3經(jīng)過加工，成為胞質(zhì)可溶性的LC3Ⅰ，常規(guī)表達;當(dāng)自噬啟動時，LC3Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3Ⅱ〔13，14〕。LC3Ⅱ與 BNIP3二聚體上的 LC3結(jié)合區(qū)域結(jié)合參與誘導(dǎo)自噬〔14〕。

Kanno等〔13〕通過免疫熒光觀測發(fā)現(xiàn)SCI后脊髓組織LC3Ⅱ和BNIP3的表達也升高，這與本研究的檢測結(jié)果相符。正常的神經(jīng)細(xì)胞中不能檢測到 BNIP3，但是SCI后神經(jīng)細(xì)胞缺血、缺氧時誘發(fā)自噬，導(dǎo)致BNIP3表達增高，本實驗中也證實了SCI后BNIP3表達增高。另外，本結(jié)果另一個有意義的發(fā)現(xiàn)是電針治療可以顯著降低SCI后神經(jīng)細(xì)胞LC3Ⅱ和BNIP3的表達，其作用和西藥組相當(dāng)。因此，電針可以通過調(diào)節(jié)不同時間段的LC3Ⅱ和BNIP3表達而阻斷自噬信號的傳導(dǎo)，抑制自噬，從而對神經(jīng)細(xì)胞保護起到重要作用。

綜上，電針治療可以降低大鼠SCI后脊髓組織中LC3Ⅱ和BNIP3的表達，抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬，減緩SCI后病理損害。

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R683.2

A

1005-9202(2015)09-2339-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.014

遼寧省教育廳一般項目(No.L2012311)

楊 波(1975－)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。

〔2013-12-21修回〕

(編輯 苑云杰)