電針通過(guò)mTOR/P70S6K信號(hào)途徑增強(qiáng)胰島素抵抗模型大鼠對(duì)胰島素的敏感性

唐念珍 唐成林 黃思琴 楊 輝 張 毅 田 源 謝 輝 陳曉琳

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016)

電針通過(guò)mTOR/P70S6K信號(hào)途徑增強(qiáng)胰島素抵抗模型大鼠對(duì)胰島素的敏感性

唐念珍 唐成林 黃思琴 楊 輝1張 毅 田 源 謝 輝 陳曉琳

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016)

目的 探討電針對(duì)胰島素抵抗模型大鼠胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要影響因子mTOR和P70S6KmRNA表達(dá)量的影響。方法 清潔級(jí)SD雄性大鼠70只，按隨機(jī)數(shù)字表分為普食組(n=10)和模型組(n=60)，分別飼以普食和高脂高糖飲食。8 w后選取40只造模成功大鼠再一次隨機(jī)分為高脂高糖飲食(HFHCD)1、HFHCD 2、電針(EA)1、EA 2組，每組10只;HFHCD 1組和EA 1組繼續(xù)給予高脂高糖飲食，HFHCD 2組和EA 2組給予普通飲食。電針組針刺雙側(cè)“足三里”、“三陰交”、“胃脘下俞”，每次20 min，1次/d，針刺14 d。觀察大鼠體重、血糖、胰島素的變化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠mTOR和P70S6KmRNA的表達(dá)量。結(jié)果 HFHCD 1組比CD組mTOR、P70S6KmRNA明顯升高，HFHCD 2組比HFHCD 1組明顯降低，EA1組較HFHCD1組明顯降低，EA2組較HFHCD2組明顯降低，EA2組較EA1組明顯降低。結(jié)論 電針刺激胰島素抵抗大鼠“足三里”、“三陰交”、“胃脘下俞”能降低mTOR和P70S6KmRNA的表達(dá)水平，恢復(fù)胰島素信號(hào)通路的正常傳導(dǎo)，增強(qiáng)胰島素的敏感性，從而維持血糖的正常水平。

電針;胰島素抵抗;雷帕霉素靶蛋白;核糖體蛋白S6激酶

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通路(PI3K/Akt信號(hào)通路)的重要下游效應(yīng)蛋白，也是一種營(yíng)養(yǎng)素水平變化的感受器，可感受能源物質(zhì)水平的變化和細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)成分的含量等信號(hào)，并通過(guò)激活核糖體蛋白 S6激酶(P70S6K)等下游因子而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、生存和蛋白的合成等代謝過(guò)程〔1，2〕。P70S6K是介導(dǎo)胰島素抵抗(IR)關(guān)鍵因子，可增加胰島素受體底物(IRS)絲氨酸的磷酸化，從而導(dǎo)致酪氨酸磷酸化減少，進(jìn)而抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信號(hào)途徑傳導(dǎo)，而引起IR〔3〕。目前研究針刺治療IR的機(jī)制多是研究IRS-1、IRS-2、PI3-K等胰島素信號(hào)通路的上游影響因子，而

S6K對(duì)其下游通路上的mTOR和P70S6K影響的研究較少。本研究通過(guò)觀察電針對(duì)IR大鼠mTOR和P70S6KmRNA表達(dá)量的影響，探討電針改善IR的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠70只，雄性，4周齡，體重80～100 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(渝)2012-0002〕。

1.2 主要試劑及儀器 葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)于中國(guó)上海榮盛生物藥業(yè)公司;大鼠胰島素ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)R＆D公司;總RNA提取試劑購(gòu)于天根生化科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本Takara公司;熒光PCR試劑盒購(gòu)于日本Takara公司;mTOR、P70S6K引物由Invitrogen Biotechnology中國(guó)公司合成。

AU2700全自動(dòng)生化分析儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(MX3005P)，重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院提供;華佗牌針灸針(0.25 mm×13 mm)、SDZ-Ⅱ型電針治療儀，中國(guó)蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。

1.3 造模及分組 SD大鼠25℃恒溫、濕度50%左右，明暗周期12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w之后，隨機(jī)抓取10只大鼠給予普通飼料，為普食組(CD)，其余60只均給予高脂高糖飼料，為模型組。飼料配方〔4〕:基礎(chǔ)飼料60%+豬油15%+蔗糖25%(基礎(chǔ)飼料和豬油均由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。從第5周開(kāi)始，每周清晨從大鼠眼眶靜脈竇采血1次，檢測(cè)其空腹血糖(FPG)、血清胰島素(INS)，計(jì)算ISI〔ISI=1/(空腹血糖×空腹胰島素)〕，因其為偏態(tài)分布，故取其自然對(duì)數(shù)做比較。各組大鼠每周同一時(shí)間稱重一次。8 w之后，以FPG、INS均較CD組顯著升高(P＜0.01)、ISI顯著下降(P＜0.01)為IR模型制造成功的標(biāo)準(zhǔn)，最終得到IR大鼠44只。從中隨機(jī)選出40只分為高脂高糖1組(HFHCD 1)，高脂高糖2組(HFHCD 2)，電針1組(EA 1)，電針2組(EA 2)，每組10只。CD組、HFHCD 2組、EA 2組給予普食喂養(yǎng)，HFHCD 1組、EA 1組給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)。

1.4 針刺方法 每天早上9∶00將各組大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，選取雙側(cè)足三里、三陰交、胃脘下俞進(jìn)行針刺治療，足三里、三陰交斜刺5 mm，胃脘下俞斜刺3 mm，同側(cè)足三里和胃脘下俞接通電針儀，1次/d，每次20 min，連續(xù)針刺14 d。電針參數(shù)參照本課題組前期研究結(jié)果〔5〕:疏密波，頻率 20 Hz，3 mA。CD組、HFHCD 1組和HFHCD 2組不進(jìn)行針刺，但仍進(jìn)行捆綁固定，以排除大鼠應(yīng)激等因素導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)偏倚。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) (1)每周三上午由專人測(cè)量各組大鼠的體質(zhì)量，觀察各組大鼠進(jìn)食量、飲水量、精神及活動(dòng)情況。(2)采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)FPG含量。(3)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)INS含量。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 mTOR和P70S6KmRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mTOR和P70S6KmRNA表達(dá)水平。取大鼠股四頭肌100 mg用液氮研磨至粉末，裝入無(wú)菌EP管內(nèi)，用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA濃度、純度及完整性，確保A260/280比值在1.8～2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反應(yīng)條件:42℃保溫30 min，80℃5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，－20℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。目的基因及內(nèi)參基因序列通過(guò)檢索基因庫(kù)獲得，用Primer5設(shè)計(jì)引物。引物序列:mTOR 正義:5’-AGCACAAGGAGATCCGCATGGAAG-3’，反義:5’-CACCACCTGCACTGCAGTCTGG-3’，產(chǎn)物 176 bp;P70S6K 正義:5’-CCCACTGCTTTGAGCTACT-3’，反 義:5’-CTGAGGCACTCCAGGATG-3’，產(chǎn)物 265 bp;GAPDH 正義:5’-AATGGATTTGGACGCATTGGT-3’，反義:5’-TTTGCACTGGTACGTGTTGAT-3’，產(chǎn)物159 bp。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)嚴(yán)格按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性1 min;95℃→15 s，58℃→20 s，72℃→20 s;72℃延伸5 min;溶解曲線72℃ ～95℃，每20 s升溫一次1℃。采用△△CT法計(jì)算結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多組之間均數(shù)的兩兩比較采用Duncan多重檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)IR大鼠體質(zhì)量的影響 高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 w后，CD組與HFHCD組大鼠體重差異明顯(P＜0.01)，說(shuō)明體重增加與否和IR的發(fā)生并無(wú)必然聯(lián)系。針刺14 d后，HFHCD 1組大鼠體重變化不明顯(P＞0.05)，而HFHCD 2組大鼠體重變化顯著(P＜0.01)，說(shuō)明單純飲食控制對(duì)IR大鼠體重的減輕有較顯著的作用;EA組比HFHCD組大鼠體重減輕明顯(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 電針治療前后各組大鼠體重比較(±s，n=10，g)

表1 電針治療前后各組大鼠體重比較(±s，n=10，g)

與CD組比較:1)P＜0.01;與HFHCD1組比較:2)P＜0.01;與HFHCD2組比較:3)P＜0.05;與EA1組比較:4)P＜0.01

組別 治療前 治療后CD組HFHCD 1組HFHCD 2組EA 1組EA 2組357.22±10.22 278.19±11.851)278.75±8.581)273.75±8.121)275.49±9.491)372.62±15.08 276.16±10.731)240.29±15.381)2)214.66±11.201)2)201.77±8.981)3)4)

2.2 電針對(duì) IR大鼠 FPG、INS、ISI的影響 HFHCD組大鼠FPG、INS均較CD組顯著升高，而ISI顯著降低(P＜0.01)，EA組大鼠FPG、INS均較HFHCD組顯著降低，ISI顯著升高(P＜0.01)，HFHCD 2組與HFHCD 1組比較FPG差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，HFHCD 2組較HFHCD 1組INS顯著降低，ISI顯著升高(P＜0.01)，EA 2組較EA 1組FPG、INS顯著降低，ISI顯著升高(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 電針對(duì)IR大鼠FPG、INS、ISI的影響(±s，n=10)

表2 電針對(duì)IR大鼠FPG、INS、ISI的影響(±s，n=10)

組別 FPG(mmol/L) INS(mU/L)ISI CD組HFHCD 1組HFHCD 2組EA 1組EA 2組4.56±0.49 7.32±0.451)6.95±0.591)5.74±0.231)2)5.00±0.091)3)20.78±1.68 31.78±1.091)30.01±0.731)2)26.05±0.761)2)22.77±1.021)3)4)－1.97±0.56－2.37±0.031)－2.32±0.041)2)－2.17±0.021)2)－2.06±0.021)3)4)

2.3 電針對(duì)IR大鼠mTOR和P70S6KmRNA表達(dá)量的影響HFHCD1組 mTOR(3.316 6±0.271 1)和 P70S6KmRNA(2.204 9±0.249 8)表達(dá)量明顯高于CD組(設(shè)為1);HFHCD 2組mTOR(2.446 9±0.346 1)和 P70S6KmRNA(1.806 5±0.118 2)表達(dá)量較HFHCD 1組顯著降低(P＜0.01)，說(shuō)明單純飲食控制對(duì)抑制mTOR和P70S6KmRNA的表達(dá)有較顯著的作用;EA 2組較 EA 1組，mTOR(0.831 2±0.240 1 vs 1.758 9±0.279 4)和 P70S6KmRNA(0.753 7±0.129 8 vs 1.479 3±0.189 0)表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)，提示飲食控制與電針治療結(jié)合可更好地改善大鼠IR。EA組mTOR和P70S6KmRNA表達(dá)量明顯低于HFHCD組，尤其是EA 2組mTOR mRNA表達(dá)量與CD組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)，提示電針在抑制mTOR和P70S6KmRNA的表達(dá)方面有十分顯著的作用。

3 討論

胰島素發(fā)揮其正常的生理作用主要依賴于其與細(xì)胞膜上的胰島素受體結(jié)合后的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的完整性，此過(guò)程中任何一個(gè)節(jié)點(diǎn)發(fā)生磷酸化或去磷酸化障礙，都有可能導(dǎo)致IR。胰島素與其受體結(jié)合形成復(fù)合物后，其受體內(nèi)的酪氨酸被磷酸化而激活，從而激活胰島素受體底物(IRS)，進(jìn)而激活另一信號(hào)因子PI3K，活化的PI3K可使其下游靶蛋白 Akt磷酸化，Akt再使mTOR被磷酸化而激活。

在正常狀態(tài)下，mTOR/P70S6K在此通路上主要調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白合成。當(dāng)細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩時(shí)，mTOR作為一種營(yíng)養(yǎng)成分感受因子，在高濃度葡萄糖的長(zhǎng)期刺激下，會(huì)使 mTOR/P70S6K長(zhǎng)期處于激活狀態(tài)而過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而使IRS-1的絲/蘇氨酸過(guò)度磷酸化，阻礙了其酪氨酸的磷酸化，抑制了胰島素信號(hào)的正常傳導(dǎo)，使PI3K/Akt通路失活，最終導(dǎo)致IR〔6〕，從而致使高血糖癥、高胰島素血癥等。mTOR/P70S6K途徑的激活還可導(dǎo)致過(guò)氧化物酶體增殖受體γ輔激活因子α(PGC-1α)活性下降，從而導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧化代謝功能下降和線粒體功能紊亂，進(jìn)而引起 IR 和肥胖〔7〕。本課題組前期研究〔8～10〕已證實(shí)，電針可抑制肥胖大鼠體內(nèi)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ等的表達(dá)，減少脂肪細(xì)胞的數(shù)量;還可降低C反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素(IL)-6、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α等的表達(dá)，降低肥胖大鼠血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、FPG等的濃度，從而改善肥胖大鼠機(jī)體的炎癥反應(yīng)狀態(tài)〔5，9～11〕;還可增強(qiáng) IR大鼠體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子(GLUT)4的表達(dá)，抑制糖原合酶激酶(GSK)-3β的表達(dá)，從而加強(qiáng)葡萄糖的攝取、利用和轉(zhuǎn)運(yùn)。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，IR的產(chǎn)生與脾、腎、肝有關(guān)〔11〕，多因先天稟賦不足，后天飲食失節(jié)，勞倦內(nèi)傷，五志過(guò)極等導(dǎo)致脾胃受損，腎精虧虛，肝失疏泄，從而形成痰濁、瘀血、毒邪等病理產(chǎn)物〔12〕。足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)腧穴，三陰交為足太陰脾經(jīng)腧穴，脾胃為氣機(jī)升降之樞紐，共同調(diào)節(jié)全身氣機(jī)。同時(shí)，三陰交也是足三陰經(jīng)的交會(huì)穴，可調(diào)節(jié)足三陰經(jīng)之經(jīng)氣。胃脘下俞為經(jīng)外奇穴，位于足太陽(yáng)膀胱經(jīng)背部第一側(cè)線上，其下有T8神經(jīng)分布，主要支配胰腺傳入神經(jīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，體重增加與否和IR的發(fā)生并無(wú)必然聯(lián)系;而電針治療和(或)飲食控制能明顯減輕大鼠體重。IR大鼠體內(nèi)INS明顯升高，但FPG并沒(méi)有顯著降低而是升高了，說(shuō)明機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性降低十分明顯，而電針治療和(或)飲食控制對(duì)其有十分明顯的改善作用，尤其是二者配合使用療效更佳。大鼠發(fā)生IR后，體內(nèi)mTOR和P70S6KmRNA表達(dá)量明顯升高，使IRS-1絲/蘇氨酸過(guò)度磷酸化，從而抑制了其酪氨酸的磷酸化，使胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的傳導(dǎo)受到抑制。而電針治療可恢復(fù)胰島素信號(hào)的正常傳導(dǎo)，使血糖濃度下降、胰島素敏感性得以恢復(fù)。

綜上所述，電針增強(qiáng)IR模型大鼠胰島素的敏感性可能是通過(guò)減弱mTOR和P70S6KmRNA的表達(dá)，從而減少胰島素受體底物的絲/蘇氨酸的磷酸化，增加其酪氨酸的磷酸化，恢復(fù)胰島素信號(hào)通路的正常傳導(dǎo)，增強(qiáng)胰島素的敏感性，進(jìn)而維持血糖的正常水平。

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Electroacupuncture enhances insulin sensitivity of insulin resistance rats through mTOR/P70S6Ksignal pathway

TANG Nian-Zhen，TANG Cheng-Lin，HUANG Si-Qin，et al.
Chinese Medical College，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture strengthening mechanism of insulin sensitivity on the content of mTORmRNA and P70S6KmRNAin insulin resistance rat.MethodsSeventy SD rats were randomly divided into common diet(n=10)and high-fat and high-carbohydrate diet groups(n=60).Forty rats of insulin resistance in high-fat and high-carbohydrate diet group were chosen and divided into HFHCD 1，HFHCD 2，EA 1 and EA 2 groups(n=10).Electroacupuncture was applied to two-side of ST36，SP6 and EX-B3 for 20 min once daily for 14 days.The changes of body weight，blood glucose and insulin were detected.The expressions of mTOR mRNA and P70S6KmRNA in insulin resis-tance rat skeletal muscle were determined by real time fluorescence quantitative PCR.ResultsThe expressions of mTOR and P70S6KmRNA were significantly higher in HFHCD 1 group than those of CD group，they were significantly lower in HFHCD 2 group than those of HFHCD 1 group，they were significantly lower in EA1 group than those of HFHCD1 group，they were significantly lower in EA2 group than those of HFHCD2 group，they were significantly lower in EA2 group than those of EA1 group.ConclusionsEA on ST36，SP6 and EX-B3 has a beneficial regulatory effect on the expressions of mTOR and P70S6KmRNA，and restore the normal conduction of insulin singnaling pathway，and enhance insulin sensitivity，and maintain the level of blood glucose in normal.

Electroacupunctrue;Insulin resistance;mTOR;P70

R245.9+7

A

1005-9202(2015)09-2333-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.012

國(guó)家自然科學(xué)基金(81273870)

1 重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院

唐成林(1966-)，男，教授，主要從事針灸推拿的研究。

唐念珍(1989-)，女，在讀碩士，主要從事針灸推拿的研究。

〔2014-05-15修回〕

(編輯 袁左鳴)