青蒿素類藥物的藥理作用新進展

郭燕，王俊，陳正堂

（第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所，重慶 400037）

青蒿素類藥物的藥理作用新進展

郭燕，王俊，陳正堂

（第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所，重慶 400037）

植物黃蒿提取物用來治療瘧疾相關的發(fā)熱已經(jīng)有一千多年的歷史，公元340年間的東晉醫(yī)學家和煉丹化學家葛洪所著的《肘后備急方》即有關于青蒿治療瘧疾的記載。1972年，我國科研人員首次從菊科植物黃蒿中分離得到抗瘧疾的有效單體，命名為青蒿素，其衍生物包括二氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯，均含有過氧橋結構，屬于新型倍半萜內(nèi)酯化合物。除青蒿琥酯在堿性條件下可溶外，其它青蒿素衍生物均難溶于水[1]。目前，青蒿素類藥物毒性低，抗瘧疾作用強，已替代了傳統(tǒng)抗瘧藥喹啉治療瘧疾的地位，被WTO批準為在世界范圍內(nèi)治療腦型瘧疾和惡性瘧疾的首選藥物。近些年研究發(fā)現(xiàn)青蒿素類藥物還具有其它方面的藥理作用，如抗腫瘤、治療細菌膿毒癥等，使得這類藥物備受關注。

1 抗瘧疾作用

在眾多的青蒿素衍生物中，青蒿素是最早被發(fā)現(xiàn)具有抗瘧疾作用的活性物質(zhì)。后來人們對青蒿素化學結構進行了改造，人工合成了二氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯等衍生物。這些衍生物保留了原有的過氧橋結構，但穩(wěn)定性更好，殺傷瘧原蟲的作用更強，對耐藥性的瘧疾也有很好的治療作用。青蒿素不僅單藥治療瘧疾作用顯著，而且聯(lián)合治療瘧疾效果更佳。

1.1 二價鐵離子依賴的抗瘧疾作用 目前，有關青蒿素類藥物的抗瘧作用機理仍不清楚，多數(shù)人認為二價鐵離子介導了青蒿素衍生物的抗瘧作用，該作用與青蒿素的化學結構密切相關。在瘧原蟲破壞紅細胞并吞噬血紅蛋白后，瘧原蟲體內(nèi)的血紅蛋白酶，主要是天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶將吸收的血紅蛋白催化降解成游離氨基酸，同時釋放出血紅素和游離的二價鐵離子；二價鐵離子再催化青蒿素類物質(zhì)中的過氧橋裂解，產(chǎn)生大量以青蒿素炭原子為中心的自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS），它們將修飾或抑制瘧原蟲生長所需要的大分子物質(zhì)或破壞瘧原蟲生物膜結構，最終導致瘧原蟲死亡[2]。

1.2 抑制血紅素的內(nèi)化 已知血紅素經(jīng)蟲體的解毒機制聚合成不溶水的、無活性的結晶物質(zhì)，即瘧色素，其儲存于蟲體食物空泡內(nèi)。氯喹對血紅素具有較強的親和力，它通過競爭性結合血紅素從而拮抗青蒿素的抗瘧作用，但青蒿素能抑制血紅素的內(nèi)化，從而阻斷瘧原蟲對鐵離子和蛋白質(zhì)的利用[3]。去鐵胺、苯甲酰腙吡哆醛和1，2-二甲基-3-羥基吡啶-4-酮等鐵螯合劑均可滲透入紅細胞膜，抑制青蒿素和蒿乙醚的抗瘧作用[4]。Hoppe 等[5]直接觀察到青蒿素可以長時間（12 h）和短時間（5 h）抑制瘧原蟲對大分子物質(zhì)的內(nèi)化，最高抑制率達到85%。這說明血紅素必須進入食物空泡內(nèi)才能釋放鐵離子，青蒿素抑制血紅素內(nèi)化可能是其抗瘧作用機理之一。

1.3 與抗炎作用有關 血紅素是迄今所知生物體內(nèi)最強的脂質(zhì)過氧化反應的催化劑，具有刺激單核-巨噬細胞釋放炎癥細胞因子的作用。已經(jīng)證實多種促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、巨噬細胞游走抑制因子（MIF）、白細胞介素-12（IL-12）與瘧疾患者發(fā)熱和肝損傷有密切相關。Aldieri等[6]發(fā)現(xiàn)，青蒿素可顯著抑制誘導性NO合酶的合成、促炎細胞因子的釋放，其作用可能與其抑制核轉錄因子NF-kB的激活有關，因為已經(jīng)證實多種倍半萜內(nèi)酯化合物包括青蒿素類藥物是NO合酶基因表達的強抑制劑，它們可通過烷化NF-kB 或阻斷抑制性蛋白IkB的降解削弱NF-kB的活性。

1.4 增加細胞內(nèi)鈣離子水平 最近, Eckstein-Lud-wig等[7]認為青蒿素的抗瘧疾作用可能與其抑制瘧原蟲肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜鈣離子依賴的ATP酶（the sarco/endoplasmic reticulum calcium-dependent ATP kinase，SERCA）活性有關。瘧原蟲SERCA與人體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶功能十分相似。正常情況下，這種酶可以通過將鈣離子排出細胞外來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的鈣離子水平。青蒿素抑制SERCA活性可使細胞內(nèi)鈣離子水平升高，細胞隨之凋亡，給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子抑制劑Thapsigargin可以競爭性抑制青蒿素對SERCA的作用。而且，即使青蒿素阻斷了瘧原蟲SERCA的活性，促使細胞死亡，但并不影響正常細胞的鈣排出活動[8]。

2 抗腫瘤作用

體內(nèi)和體外實驗證實，青蒿素及其衍生物對多種人類和動物腫瘤細胞均具有毒性作用，包括黑色素瘤細胞、腎癌細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤細胞、肺癌細胞等。而且同一種衍生物對不同類型腫瘤細胞的作用強度不同，具有選擇性。在一項體外抗腫瘤實驗中發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯對腸道腫瘤細胞和白血病細胞的抑制作用較強，而對肺小細胞癌細胞的殺傷作用較弱，其作用強度不到腸腫瘤細胞和白血病腫瘤細胞的1/20[9]。此外，Beekman等[10]研究了二氫青蒿素抑制四種腫瘤細胞的增殖作用，發(fā)現(xiàn)其對宮頸癌Hela細胞的抑制作用較強，IC50為8.5 ～32.9 mmol·L-1。二氫青蒿素處理24 h后的人乳腺癌MCF7 排列疏松，呈分離狀態(tài)，35.6%的細胞出現(xiàn)死亡，IC50為0.31 mmol·L-1。而青蒿素對MCF-7細胞增殖僅有微弱抑制作用。10 μmol·L-1青蒿素引起的MCF-7細胞凋亡和直接細胞毒作用與1 μmol·L-1的青蒿琥酯作用相當[11]。

在小鼠腫瘤移植瘤模型中發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能顯著抑制人卵巢癌細胞HO-8910異種移植腫瘤的生長。在用100 mg·kg-1的青蒿琥酯連續(xù)治療15 d后，小鼠腫瘤生長抑制率達62%[12]。這說明不同衍生物的抗腫瘤活性有所不同，具有選擇性，推測其原因可能是來源于它們的親脂性不同。其抗癌活性與化合物的構象、靶蛋白的差異相關。

2.1 誘導腫瘤細胞凋亡 Yamachika等[13]系統(tǒng)比較了青蒿素和常規(guī)化療藥5-氟尿嘧啶（5-FU）對口腔癌細胞IHGK的影響，發(fā)現(xiàn)青蒿素不同于5-FU對細胞的直接殺傷作用，其主要作用是誘導腫瘤細胞凋亡。Singh等[14]報道青蒿素可以誘導類人淋巴母細胞Molt-4細胞凋亡，而不是壞死。而且在鐵轉運蛋白的協(xié)助下，青蒿素的誘導凋亡作用更顯著。青蒿素衍生物青蒿琥酯不但能抑制人肝癌細胞H22和BEL-7402的增殖，而且能誘導腫瘤細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，誘導的凋亡與Bcl-2 基因、PCNA基因表達下調(diào)和bax蛋白表達升高相關。Efferth等[15]分析了青蒿素對55種人腫瘤細胞相關基因的影響，這些基因包括藥物抵抗基因、DNA損傷與修復基因、凋亡調(diào)控基因、增殖相關基因、原癌基因、腫瘤抑制基因和細胞因子基因。最近Disbrow等[16]的研究表明，兩種青蒿素衍生物二氫青蒿素和青蒿琥酯均對人類乳頭瘤病毒的宮頸上皮細胞具有毒性作用；對狗口腔乳頭瘤病毒誘導的口腔癌形成也具有抑制作用。進一步發(fā)現(xiàn)這種疏水性的藥物可以自由穿透上皮細胞表面，從而誘導線粒體半胱天冬酶表達進而啟動細胞凋亡，而且這一凋亡過程是P53 蛋白非依賴性的，表明青蒿素及其衍生物可以用來預防和逆轉病毒介導的腫瘤病變。

2.2 二價鐵離子介導的細胞毒作用 青蒿素及其衍生物的抗腫瘤作用機制目前還不完全清楚。但大量證據(jù)顯示，青蒿素的抗腫瘤作用機制與其抗瘧機制十分相似。研究表明，二價鐵和鐵轉運蛋白在紅細胞和腫瘤細胞中的含量較正常細胞高。處于對數(shù)生長期的細胞對二價鐵離子的吸收逐步增加，而腫瘤細胞鐵離子的吸收與腫瘤細胞增殖呈正相關。二價鐵參與了青蒿素的抗瘧作用，同樣也可能介導了青蒿素對腫瘤細胞的毒性作用。首先，鐵傳遞蛋白及硫酸氨基乙酸亞鐵能顯著增加青蒿素等衍生物的細胞毒性作用，對兩種腫瘤細胞CCRF-CEM和U373的細胞毒性與單用青蒿素比較增加了1.3～1.5倍，但對正常人外周血單個核細胞沒有影響，可能原因是外周血單個核細胞膜上轉鐵蛋白受體表達量不足腫瘤細胞的1.3%。將外源性的鐵轉運蛋白和青蒿素共價耦聯(lián)后，再與腫瘤細胞孵育可以大大提高青蒿素殺傷腫瘤細胞的效率。其次，鐵轉運蛋白可以增加青蒿素對耐藥肺癌細胞株H69VP的殺傷作用,而不是非耐藥細胞株H69。將耐藥細胞株用880 nmol·L-1的鐵轉運蛋白預處理后4 h后，IC50從24 nmol·L-1降至504 nmol·L-1[17]。此外，腫瘤細胞不僅僅高表達鐵轉運蛋白，而且高表達轉鐵蛋白受體。轉鐵蛋白受體介導了細胞對鐵離子的吸收和利用過程；抗轉鐵蛋白受體單克隆抗體RVS10能逆轉鐵轉運蛋白協(xié)同青蒿素殺傷CCRF-CEM和U373細胞的作用[18]。McCarty等[19]的研究表明，抗血管生成藥物治療會上調(diào)腫瘤細胞低氧誘導因子1（HIF-1）的表達，這加重了腫瘤治療的負擔，因為HIF-1 表達與耐藥相關，并增加轉鐵蛋白受體表達。但這恰恰擴大了青蒿素治療耐受性腫瘤的空間。

2.3 氧自由基介導的細胞毒作用 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)亞鐵離子的氧化還原特性可以增加腫瘤細胞對過氧化氫的敏感性，而腫瘤細胞一旦缺少細胞內(nèi)鐵，就變得對過氧化氫不敏感性。以前認為，過氧化氫和青蒿琥酯都可以產(chǎn)生ROS和自由基。對過氧化氫抵抗的腫瘤細胞同樣對青蒿琥酯不敏感。因此，推測與青蒿素殺死瘧原蟲的機制類似，腫瘤細胞內(nèi)的二價鐵可以催化青蒿素類物質(zhì)的過氧橋裂解，產(chǎn)生大量以青蒿素炭原子為中心的自由基和ROS。自由基破壞了腫瘤細胞膜即導致細胞內(nèi)物質(zhì)外漏，從而殺死腫瘤細胞[20]。

2.4 抑制血管生成 Wartenberg等[21]報道青蒿素可以抑制正常小鼠胚胎血管生成，并增加血管通透性，同時下調(diào)HIF-1、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達。而自由基清除劑如維生素E可以逆轉青蒿素的抗血管生成作用。這些結果表明青蒿素的抗血管生成作用與其產(chǎn)生的自由基密切相關。在對腫瘤血管生成的研究中，Chen等[22]報道了二氫青蒿素和青蒿素均可抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVE）的增殖、遷移和管狀形成。進一步研究發(fā)現(xiàn)，另一衍生物青蒿琥酯能顯著降低人卵巢腫瘤細胞HO-8910異體移植的小鼠腫瘤組織微血管密度（LVD），對腫瘤細胞、HUVE的VEGF及其受體血管內(nèi)皮生長因子受體1（VEGFR-1）的表達均具有抑制作用。其中對VEGFR-2的抑制率可達到80%；而青蒿琥酯和二氫青蒿素及合成的青蒿素衍生物在絨毛膜尿囊膜血管新生模型中也具有相似的作用，但它們的作用強度有所不同。

2.5 增加放化療敏感性 研究還發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物不僅能單獨作用于腫瘤細胞，而且與5-FU、吡柔比星、阿霉素等抗腫瘤藥物具有協(xié)同抗腫瘤作用。Kim等[23]最近發(fā)現(xiàn)，二氫青蒿素可增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U373MG的放射敏感性，其機制可能與青蒿素增加ROS生成及抑制谷胱苷肽轉移酶（GST）的表達相關。最近，美國華盛頓大學的Singh又發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素可以與另一抗炎物質(zhì)丁酸具有協(xié)同抗腫瘤作用。丁酸是大腸細菌群合成的短鏈、具有抗炎作用的脂肪酸，對正常結腸上皮細胞具有營養(yǎng)作用。將20 μmol·L-1的二氫青蒿素和1 mmol·L-1的丁酸與Molt-4共孵育24 h幾乎可以殺死所有的腫瘤細胞，而20 μmol·L-1的二氫青蒿素和1 mmol·L-1的丁酸對腫瘤細胞的殺傷率分別為40%和32%[24]。同時發(fā)現(xiàn)藥物誘導的凋亡明顯增強。

3 抗炎作用

瘧疾患者體內(nèi)有高水平的促炎細胞因子,TNF-α和IL-12分別在瘧疾患者高熱和肝損傷的發(fā)生中起主要作用。多種倍半萜內(nèi)酯化合物包括青蒿素類藥物均可通過烷化NF-kB或阻斷抑制性蛋白IkB的降解削弱NF-kB的活性表明，提示核轉錄因子NF-kB可能是青蒿素類藥物抑制促炎因子釋放的主要靶點。

在研究青蒿素抗內(nèi)毒素的研究中，梁愛華等[25]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對內(nèi)毒素（LPS）及合并干擾素刺激小鼠腹腔巨噬細胞NO的合成有明顯的抑制作用；青蒿琥酯對LPS 刺激的小鼠腹腔巨噬細胞RAW 264.7具有相同的保護作用，而且隨青蒿琥酯濃度的增加青蒿琥酯對NO產(chǎn)生的抑制作用也增強，青蒿琥酯對LPS誘導的TNF-α產(chǎn)生具有明顯的抑制作用，與LPS單獨應用比較抑制率達58%；青蒿素可降低LPS休克小鼠體內(nèi)LPS、TNF-α、P450濃度，升高超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低小鼠死亡率，延長小鼠的平均生存時間，對內(nèi)毒素休克小鼠肝、肺組織也有一定的保護作用[26]。前期的研究也顯示，青蒿素可抑制多種致炎因子包括刺激性的CpG寡核苷酸（ODN containing CpG，CpG ODN）或熱滅活的大腸桿菌誘導巨噬細胞釋放促炎細胞因子TNF-α、IL-6[27,28]。青蒿素抑制CpG ODN誘導的促炎因子釋放的確切機制并不清楚，推測可能與青蒿素抑制CpG ODN的內(nèi)化有關，因為CpG ODN必須先進入細胞才能與受體TLR9結合啟動炎癥反應通路，此過程中一種籠合蛋白（clathrin）和細胞上的某種受體可能參與了細胞對CpG ODN的內(nèi)吞過程；也可能與青蒿素影響TLR9 mRNA和蛋白的表達有關或影響受體與配體間的相互作用，或直接抑制轉錄因子，如NF-kB和AP-1的活化[29]。

4 治療寄生蟲病

1982年，Chen等最早研究了青蒿素的抗血吸蟲作用，后來Le等又報道了青蒿素衍生物蒿甲醚和青蒿琥酯可用于治療血吸蟲病。青蒿素類藥物抗血吸蟲有以下特點：1）對不同屬的血吸蟲均有殺傷作用，如日本血吸蟲、曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲，但作用敏感性不同，對于日本血吸蟲，感染后1～2周時效果好，而對于曼氏血吸蟲需要2～3周才能獲得最佳效應；2）對血吸蟲的童蟲作用顯著，殺傷率最高可達70%～80%，但對成蟲作用較弱，不到40%，提示其作用具有階段性；3）對兔、小鼠和倉鼠血吸蟲模型均具有很強的治療作用，臨床試驗安全性好，蒿甲醚和青蒿琥酯的臨床使用的推薦劑量分別為16和6 mg·kg-1；4）殺傷血吸蟲童蟲的同時，對蟲卵引起的損傷具有保護作用；5）聯(lián)合使用蒿甲醚和吡喹酮治療效果更好、更安全，對不同發(fā)育階段的蟲體包括成蟲和幼蟲均有顯著作用[30]。

關于青蒿素類藥物抗血吸蟲的作用機制已經(jīng)進行了探索，但確切的機制仍未闡明。證據(jù)顯示，蒿甲醚對蟲體糖原、蛋白質(zhì)含量以及ATP 酶的活性均有影響，能抑制到糖原合成和利用過程中的多種酶活性。例如蒿甲醚可增強磷酸化酶活性，分解糖原；抑制乳酸脫氫酶，減少蟲體糖酵解的終產(chǎn)物乳酸含量；抑制6-磷酸葡萄糖脫氫酶和三磷酸腺苷酶活性。此外，蒿甲醚對小鼠體內(nèi)日本血吸蟲已糖激酶、磷酸葡萄糖異構酶和磷酸果糖激酶活性的抑制作用，表明糖酵解途徑中的關鍵酶可能也是青蒿素類藥物的靶標之一[31]。

在抗其它寄生蟲的研究中，人們發(fā)現(xiàn)青蒿素類藥物對卡氏肺孢子蟲和陰道毛滴蟲的殺傷作用。最近，廖琳等[32]觀察了二氫青蒿素體外抗陰道毛滴蟲的作用。將陰道毛滴蟲與不同質(zhì)量濃度的二氫青蒿素共同孵育24～ 72 h 后，發(fā)現(xiàn)其最低殺滅劑量為2.5 mg·ml-1，最低抑制劑量為1.25 mg·ml-1。李文桂等[33]研究了二氫青蒿素治療后卡氏肺孢子蟲肺炎（PCP）大鼠模型肺部病理學變化，動物用60 mg·kg-1二氫青蒿素治療后，光鏡和電鏡觀察到中卡氏肺孢子蟲包囊數(shù)目顯著減少，肺組織炎癥明顯減輕，滋養(yǎng)體表膜和核膜破裂，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空泡和高電子密度顆粒，Pc包囊中也出現(xiàn)空泡，囊內(nèi)小體變性壞死，提示二氫青蒿素可殺死卡氏肺孢子蟲滋養(yǎng)體和包囊，從而減輕肺組織的炎癥反應。后來進一步的研究證實，二氫青蒿素抗肺孢子蟲作用與其抑制促炎細胞因子TNF-α、IL-1β釋放有一定的關系。

5 小結

青蒿素發(fā)現(xiàn)至今還不到40 年的時間，作為我國第一個真正意義上走上世界的中藥，已經(jīng)引起了廣泛關注。在WHO批準用這類藥物用于治療瘧疾的同時，全世界包括中國的藥廠也瞄準了青蒿素帶來的無限商機。目前，國際上對青蒿素需求的日益擴大，使得國內(nèi)正在擴大青蒿種植和生產(chǎn)規(guī)模，并試圖應用現(xiàn)代生物技術提高產(chǎn)率或人工合成青蒿素。最近，最初發(fā)現(xiàn)青蒿素具有抗癌作用的美國華盛頓大學正式與重慶華立控股公司和華立制藥簽約，研發(fā)新的青蒿素抗癌藥物，這無疑使青蒿素類藥物再添光輝。由于青蒿素類藥物在治療腫瘤、血吸蟲方面與治療瘧疾一樣具有獨特的優(yōu)勢，如價格低廉、靶向性強，毒副作用少，可以用于單藥、聯(lián)合治療腫瘤和腫瘤預防。因此，可以肯定，青蒿素類藥物的作用方興未艾，增加青蒿素的適應癥對提高青蒿素的利用、增加其經(jīng)濟價值具有重要意義。

摘編自《中國臨床藥理學與治療學》2006年第6期：615～620頁，圖、表、參考文獻已省略。