自噬對(duì)肝卵圓細(xì)胞在缺血缺氧微環(huán)境中增殖的影響

段文彪，高勝?gòu)?qiáng)，周春光，趙延榮，李倉(cāng)，孫克龍，單云峰，張啟瑜

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325000）

肝卵圓細(xì)胞（hepatic oval cell，HOC）是一種具有多向分化潛能的肝臟干細(xì)胞，能夠分化為成熟肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等，在一些人肝臟疾病的肝組織中均發(fā)現(xiàn)HOC增生，且增殖數(shù)量與肝病嚴(yán)重程度相關(guān)[1-2]。肝卵圓細(xì)胞的臨床應(yīng)用需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題是闡明卵圓細(xì)胞活化、增殖和按特定的分化途徑分化的調(diào)控機(jī)制。自噬（autophagy）是將細(xì)胞內(nèi)受損、變性或者衰老的蛋白質(zhì)以及受損細(xì)胞運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解的過(guò)程，是細(xì)胞應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏、細(xì)胞密度負(fù)荷、低氧、氧化應(yīng)激、感染等惡劣環(huán)境的生存方式之一[3]。自噬作為細(xì)胞保持穩(wěn)定狀態(tài)的管家機(jī)制，可調(diào)控長(zhǎng)壽蛋白、過(guò)氧化物酶體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的更新；自噬還可作為一種防御機(jī)制，清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細(xì)胞器、代謝產(chǎn)物，進(jìn)行亞細(xì)胞水平上的重構(gòu)，保護(hù)受損的細(xì)胞[4]。缺血缺氧能否誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞自噬以及自噬對(duì)肝卵圓細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境中是否有保護(hù)作用還鮮有報(bào)道，本研究對(duì)此進(jìn)行了探討。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠肝干細(xì)胞系（卵圓細(xì)胞）WB-F344購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；氯喹（Chloroquine，CQ）、丹（磺）酰戊二胺（Monodansylcadaverine，MDC）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β（LC3B）蛋白多克隆抗體、兔抗鼠βactin單克隆抗體和羊抗兔IgG（H+L）HRP（美國(guó)Sigma公司）；DMSO（北京索萊寶公司）；CCK-8（日本同仁化學(xué)公司）；胎牛血清、1640培養(yǎng)液、PBS（GIBCO公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-2 Rad公司）；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。密封培養(yǎng)罐、AnaeroPack（安寧包）產(chǎn)氣袋和氧氣指示劑（日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社）；Hoechst33258染色液、BCA法蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠肝卵圓細(xì)胞WB-F344接種于含1%青鏈霉素、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，細(xì)胞計(jì)數(shù)后置入缺血缺氧微環(huán)境中進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 缺血缺氧模型建立：將肝卵圓細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，換成無(wú)血清1640培養(yǎng)基，放入密封培養(yǎng)罐后迅速放入安寧包產(chǎn)氣袋一袋和氧氣指示劑一枚，密封，45 min后開始計(jì)時(shí)。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)：采用CCK-8法。取細(xì)胞密度為8×104/L 100μL細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。棄舊培養(yǎng)液后實(shí)驗(yàn)組加入100μL無(wú)血清1640培養(yǎng)液，對(duì)照組加入100μL 10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，按上述分組及實(shí)驗(yàn)處理后；每孔加入10μL CCK-8后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、2 h后于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處分別檢測(cè)各孔吸光度（OD值），細(xì)胞生存率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值）/（對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值）×100%。

1.2.4MDC熒光染色：取細(xì)胞爬片，移去培養(yǎng)液，PBS洗2次，重新加入含有50μmol/LMDC的培養(yǎng)基在37℃孵育1 h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗三遍，抗熒光淬滅劑于載玻片上封片，置于DM 4000 B LED熒光正置顯微鏡上，用380 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光525 nm波長(zhǎng)的發(fā)射光濾光片進(jìn)行觀察。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光：取細(xì)胞爬片，PBS洗3遍，4%預(yù)冷的多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次；0.2% Triton X-100通透10 min，PBS洗3遍；血清封閉30 min，PBS洗3次；加一抗，4 ℃過(guò)夜，PBS洗3次；加二抗，37 ℃濕盒內(nèi)1 h，PBS洗3次，甘油封片，熒光下拍片。

1.2.6 蛋白免疫印跡：提取細(xì)胞蛋白后，BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，20μL總蛋白，12%的SDS-PAGE電泳，切膠，以350 mA恒流濕轉(zhuǎn)膜70 min；5%脫脂奶粉封閉90 min，分別加LC3B、β-actin一抗（均為1:500）4 ℃孵育過(guò)夜，37 ℃復(fù)溫30 min，TBST洗三次，加5%脫脂奶粉配制二抗（1:5000），常溫下孵育90 min后，TBST洗3次，暗室中ECL發(fā)光、曝光。

1.2.7Hoechst 33258染色：取細(xì)胞爬片，棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗兩次，Hoechst 33258染色5 min，PBS洗兩次，滴加抗熒光淬滅劑于載玻片上封片，熒光顯微鏡觀察，并隨機(jī)選取視野拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1CCK-8法檢測(cè)WB-F344細(xì)胞在缺血缺氧中的存活率

結(jié)果顯示，從2 h開始，與對(duì)照組比較細(xì)胞存活率差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。隨著缺血缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率明顯降低。相同缺血缺氧時(shí)間段內(nèi)，加入氯喹與未加氯喹相比，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05，表1）。

2.2 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）是酵母Atg8的同源體，調(diào)控微管蛋白的組裝和去組裝，參與自噬體形成，主要在自噬體表達(dá)，與對(duì)照組相比，隨著缺血缺氧的時(shí)間的延長(zhǎng)，肝卵圓細(xì)胞胞漿LC3表達(dá)量顯著上升（圖1）。

表1 抑制自噬前后HOC在缺血缺氧中的存活率（%）

2.3 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

LC3是檢測(cè)自噬現(xiàn)象的特異性標(biāo)記分子，LC3-II/LC3-I反映自噬程度。Western blotting觀察到，相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，缺血缺氧作用細(xì)胞后LC3-II與LC3-I的比值和LC3-II的表達(dá)都顯著增加（圖2）。

2.4 MDC染色熒光檢測(cè)自噬變化

MDC是一種相對(duì)特異性自噬標(biāo)記物，它可被細(xì)胞吸收并選擇性地聚集于自噬體中[4]。激光共聚焦顯微鏡觀察到染上MDC熒光的自噬體呈點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，散布于胞漿及核周，因此可根據(jù)細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒的變化來(lái)推斷自噬的活化。HOC加入自噬抑制劑前后進(jìn)行不同時(shí)間的缺血缺氧，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，缺血缺氧誘導(dǎo)大量熒光顆粒分布于肝卵圓細(xì)胞胞漿及核周，顯著高于正常對(duì)照細(xì)胞。重復(fù)試驗(yàn)三次，每次觀察100個(gè)細(xì)胞，單純?nèi)毖毖踅MMDC陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)其百分率高于對(duì)缺血缺氧+氯喹組（P＜0.05）。

圖1 缺血缺氧后不同時(shí)間LC3的細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果（×400）

A圖 LC3-I、LC3-II蛋白表達(dá)

圖2 缺血缺氧后不同時(shí)間LC3-II、LC3-I蛋白表達(dá)（A圖）及LC3-II/LC3-I比率變化（B圖）情況

2.5Hoechst 33258染色觀察抑制自噬前后細(xì)胞凋亡

隨著缺血缺氧時(shí)間延長(zhǎng)凋亡細(xì)胞增加。缺血缺氧處理相同時(shí)間比較，抑制自噬后比抑制前凋亡細(xì)胞明顯增多，凋亡特征更明顯。

3 討論

肝卵圓細(xì)胞是肝內(nèi)的干/祖細(xì)胞，兼具干細(xì)胞、肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的許多表型特點(diǎn)，具有多向分化潛能，與肝臟的再生和腫瘤形成密切聯(lián)系[5]。由于肝卵圓細(xì)胞具備體外自我復(fù)制、克隆增殖及分化為肝細(xì)胞的能力，并可進(jìn)行體外基因修飾，因此其為肝衰或肝病時(shí)細(xì)胞移植、組織工程和基因治療帶來(lái)新的希望。肝卵圓細(xì)胞的臨床應(yīng)用需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題是闡明卵圓細(xì)胞活化、增殖和按特定的分化途徑分化的調(diào)控機(jī)制。自噬是細(xì)胞應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏、細(xì)胞密度負(fù)荷、低氧、氧化應(yīng)激、感染等惡劣環(huán)境因素的生存機(jī)制之一[3]。研究自噬在肝卵圓細(xì)胞活化和增殖中的作用，以及肝卵圓細(xì)胞通過(guò)自噬適應(yīng)微環(huán)境的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)于深入理解肝卵圓細(xì)胞參與肝再生、肝癌的發(fā)生以及肝卵圓細(xì)胞臨床運(yùn)用等均具有重要意義。

圖3 自噬抑制前后MDC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化情況

自噬（autophagy）最早是由Ashford和Porten在人的肝細(xì)胞中觀察到的[6-7]，又稱為II型程序性細(xì)胞死亡，是真核細(xì)胞通過(guò)溶酶體降解其自身的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，實(shí)行“自我消化”的一系列生化過(guò)程[8]。在這個(gè)過(guò)程中，首先是細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器被雙層膜包裹形成自噬泡，然后再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最終使被包裹的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器降解[9]。Hourdry于1977年在即將死亡的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象，提出自噬能促進(jìn)細(xì)胞存活。自噬對(duì)于細(xì)胞的合成與降解的作用，在維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)方面有著重要的意義[3]。當(dāng)機(jī)體或細(xì)胞處于饑餓，能量缺失等不利狀態(tài)時(shí)，自噬體降解機(jī)體長(zhǎng)壽蛋白或殘存的細(xì)胞器，轉(zhuǎn)換為基本氨基酸提供能量，維持機(jī)體或細(xì)胞的生存[10]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）是自噬體標(biāo)志蛋白中比較重要的一種，參與自噬體形成過(guò)程并占有重要地位。其前體可在自噬過(guò)程啟動(dòng)時(shí)被加工成可溶性LC3，后經(jīng)Atg3和Atg7活化修飾，變?yōu)榻Y(jié)合式LC3-II，當(dāng)自噬體形成后，LC3-I和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶聯(lián)形成LC3-II并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜。與其他一些定位于自噬性結(jié)構(gòu)膜上的Atg蛋白不同，與溶酶體融合前LC3-II始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上，因此被用來(lái)作為自噬體的標(biāo)記，因此LC3蛋白可作為反映自噬水平的標(biāo)記物[11]，且LC3-II的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量[12]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β（LC3B）作為L(zhǎng)C3蛋白中的一種，其含量也可反映細(xì)胞自噬水平的強(qiáng)弱，在自噬形成中，LC3-I與LC3-II/LC3-I比例與自噬體數(shù)量有關(guān)[13]。

盡管己有國(guó)內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)組織細(xì)胞發(fā)生自噬的誘導(dǎo)因素，但關(guān)于缺血缺氧能否誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞自噬鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧環(huán)境能夠激活肝卵原細(xì)胞自噬程序，主要觀察到以下三點(diǎn)：（1）缺血缺氧體外微環(huán)境能夠誘導(dǎo)干卵圓細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3表達(dá)上調(diào)；（2）MDC熒光染色顯示，缺血缺氧誘導(dǎo)大量熒光顆粒分布于肝卵圓細(xì)胞胞漿及核周，顯著高于正常對(duì)照細(xì)胞；（3）CQ可以通過(guò)抑制溶酶體的酸化而阻斷自噬作用[14]，加入CQ后MDC染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組相比以及與單純?nèi)毖毖跸嗤瑫r(shí)間相比增加不明顯（P＞0.05)。

圖4Hoechst 33258染色觀察抑制自噬前后細(xì)胞凋亡（×400）

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了肝卵圓細(xì)胞缺血缺氧模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺血缺氧不同時(shí)間可以誘導(dǎo)HOC自噬的大量產(chǎn)生，8 h自噬顯著增強(qiáng)。氯喹作為一種靶向溶酶體的藥物，可通過(guò)改變?nèi)苊阁w內(nèi)的pH值影響自噬溶酶體對(duì)包裹蛋白質(zhì)的降解，抑制磷脂酶A2、溶血磷脂?；饷敢约皢熙；视椭久富钚?，從而抑制酸性依賴性自噬作用，導(dǎo)致自噬體內(nèi)物質(zhì)不能被溶酶體降解而引起自噬性囊泡在細(xì)胞內(nèi)堆積，溶酶體膜通透性改變使溶酶體腫脹、破裂而致細(xì)胞死亡，從而阻斷自噬的最后一步[14-15]。應(yīng)用CQ特異的抑制自噬，肝卵原細(xì)胞缺血缺氧后，自噬減少，HOC存活率顯著降低，凋亡增加，凋亡特征更明顯。因此，我們推測(cè)缺血缺氧誘導(dǎo)的自噬體具有保護(hù)肝卵圓細(xì)胞的功能，促進(jìn)細(xì)胞的生存，缺血缺氧誘導(dǎo)的自噬可能吞噬殘余的細(xì)胞器，釋放必需氨基酸，從而維持細(xì)胞的生存和功能。自噬體的產(chǎn)生在一定時(shí)間內(nèi)可以延緩或阻止細(xì)胞調(diào)亡，可能與HOC在缺血缺氧微環(huán)境中細(xì)胞的生存和功能的維持有關(guān)。

綜上所述，研究HOC自噬對(duì)于深入理解HOC參與肝再生、肝癌的發(fā)生以及HOC臨床運(yùn)用等均具有重要意義。

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