3種不同劑量的青蒿琥酯抗小鼠細(xì)粒棘球蚴疾病作用的比較

張宏偉，彭心宇，吳向未，楊宏強(qiáng)，呂海龍，張示杰

3種不同劑量的青蒿琥酯抗小鼠細(xì)粒棘球蚴疾病作用的比較

張宏偉，彭心宇，吳向未，楊宏強(qiáng)，呂海龍，張示杰

目的 探討高、中、低3種不同劑量青蒿琥酯體內(nèi)抗包蟲(chóng)的作用。方法 建立小鼠腹腔細(xì)粒棘球蚴疾病模型，隨機(jī)分為4組，每天分別給與高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)3種劑量的青蒿琥酯注射液以及生理鹽水，腹腔注射治療3月后，觀察小鼠體內(nèi)包蟲(chóng)囊腫的外觀發(fā)育情況、囊濕重、包蟲(chóng)囊壁的病理改變、電鏡下超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 中劑量組小鼠總囊重明顯少于其他各組。中等劑量組抑囊率高于其他各組。病理及電鏡發(fā)現(xiàn)3種劑量下包蟲(chóng)囊壁均有不同程度的破壞，其中中等劑量組囊腫中到重度破壞，角皮層紋理模糊，生發(fā)層細(xì)胞減少，甚至斷裂，細(xì)胞核及線粒體溶解或退變。結(jié)論 在相同的飼養(yǎng)條件下，中等劑量的青蒿琥酯注射液治療小鼠腹腔細(xì)粒棘球蚴疾病的效果最佳。

細(xì)粒棘球蚴;青蒿琥酯;劑量;治療作用

細(xì)粒棘球蚴病是威脅人類健康的全球性的寄生蟲(chóng)病，目前的治療方法以手術(shù)治療為主，藥物治療為輔。對(duì)于失去手術(shù)指征的患者，藥物治療是唯一的選擇，因此關(guān)于藥物治療包蟲(chóng)病的研究一直備受關(guān)注?？汞懠驳囊痪€藥物青蒿琥酯，作為免疫調(diào)節(jié)劑，在防治寄生蟲(chóng)方面的研究逐漸成為熱點(diǎn)，但其用量與免疫效果之間關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。本研究通過(guò)建立小鼠腹腔細(xì)粒棘球蚴模型，取高、中、低3種劑量的青蒿琥酯注射液治療3月，觀察其抗包蟲(chóng)治療效果，從而尋求最佳治療劑量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及藥品準(zhǔn)備 雌性昆明小鼠60只，體重(20±5) g，由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。青蒿琥酯注射液桂林南藥股份有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)ZA080103，使用時(shí)溶解于5%碳酸氫鈉溶液，并用生理鹽水稀釋到所需的濃度。

1.2 動(dòng)物模型的建立 從自然感染的綿羊肝細(xì)粒棘球蚴囊中無(wú)菌抽取囊液，自然沉淀后去上清，收集原頭節(jié)，反復(fù)用生理鹽水沖洗，1 000 r/min離心數(shù)次，去上清液，伊紅染色，鏡下活檢計(jì)算其活性率為80%以上 ，將原頭節(jié)稀釋到1 500個(gè)/mL，加入使每毫升均含青霉素和鏈霉素各500 U，每只小鼠注射1 mL稀釋液約1 500個(gè)原頭節(jié)。采取多點(diǎn)注射，保證接種均一性。

1.3 給藥方法 將包蟲(chóng)模型小鼠隨機(jī)分為4組，高劑量組、中劑量組、低劑量組和模型對(duì)照組，每組15只，每天分別腹腔注射1次青蒿琥酯注射液200 mg/kg，100 mg/kg，50 mg/kg和等劑量的生理鹽水，接種后第2 d開(kāi)始，連續(xù)治療3個(gè)月，解剖測(cè)量。

1.4 療效評(píng)價(jià)

1.4.1 體外直接殺滅作用觀察 取20%的鹽水作對(duì)照，選取10 min，20 min，30 min時(shí)間點(diǎn)，5%伊紅染色，光鏡下觀察青蒿琥酯注射液的混勻處理的原頭節(jié)的存活情況，判斷是否能用于術(shù)中滅活原頭節(jié)。

1.4.2 細(xì)粒棘球蚴囊的大體觀察 肉眼觀察細(xì)粒棘球蚴囊發(fā)育的外觀形態(tài)。

1.4.3 細(xì)粒棘球蚴囊濕重 停藥后第2 d，摘取腹腔全部囊稱重，計(jì)算抑制率。

抑制率=(C-T)/C×100%(C：對(duì)照組囊濕重均值；T：治療組囊濕重均值)

1.4.4 病理組織學(xué)觀察 取細(xì)粒棘球蚴囊腫，用10%的中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，HE染色、切片，按照細(xì)粒棘球蚴囊生發(fā)層病理?yè)p傷程度分為3級(jí)，一級(jí)(正常)：生發(fā)層細(xì)胞核及胞質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰完整，角質(zhì)層紋理清晰；二級(jí)(變性)：生發(fā)層或角質(zhì)層空泡樣或顆粒樣變性，基質(zhì)溶解；三級(jí)(壞死)生發(fā)層細(xì)胞核固縮、溶解、消失，角質(zhì)層崩解或嗜酸性壞死。

1.4.5 透射電鏡觀察 部分棘球蚴囊置4%戊二醛前固定，四氧化鋨后固定，丙酮梯度脫水，EPDN.812包埋，超薄切片，置銅網(wǎng)上經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鋁雙重染色后，透射電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 體外直接殺滅頭節(jié)效果 青蒿琥酯注射液處理頭節(jié)，10～30 min內(nèi)觀察，在原頭蚴周圍出現(xiàn)環(huán)形隔離帶，將原頭節(jié)與外界溶液隔離，頭節(jié)染色效果不明顯，內(nèi)部結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，頭節(jié)存活(圖1)。20%濃鹽水在10 min時(shí)，0.5%伊紅染色，高倍鏡下觀察原頭節(jié)完全紅染，糖原顆粒消失，內(nèi)部結(jié)構(gòu)無(wú)法辨認(rèn)，頭節(jié)死亡(圖2)。

Endo-staining is not satisfactory; inner structure can be identified; the protoscoleces are alive(200×).

圖1 青蒿琥酯處理頭節(jié)30 min鏡下觀察

Fig.1 Changes of protoscoleces mixed with Art for 30 min, space to isolate the protoscoleces can be observed

Inner structure can not be identified; the protoscoleces are dead.(200×)

圖2 20%濃鹽水處理頭節(jié)10 min觀察

Fig.2 Changes of protoscoleces mixed with 20% saline for 10 min, the protoscoleces are fully stained

2.2 外觀形態(tài)肉眼觀察 各實(shí)驗(yàn)組囊腫主要分布在胃小彎、肝表面以及游離于腹腔，其中對(duì)照組以及高劑量組囊腫體積較大，表面光滑透明，張力較高；中劑量組囊腫體積較小，表面渾濁，張力較??；低劑量組囊腫透亮度差，張力較高。

2.3 各組囊濕重 高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)3種劑量的青蒿琥酯注射液以及生理鹽水，腹腔注射治療3月后，電子天平計(jì)算囊濕重分別為：(0.038 8±0.004 59)g，(0.014 1±0.003 24)g，(0.021 5±0.004 87)g, (0.044 4±0.006 27)g。抑囊率分別為：12.6%，68.2%，51.5%(表1)。

表1 3種劑量青蒿琥酯治療3月后，小鼠體內(nèi)棘球蚴囊腫濕重及抑囊率

Tab.1 Comparison of hydatid cyst wet weight and inhibition rate between control and treated groups in mice

Note: Compared with control,P<0.01,F=11.2.

2.3 組織學(xué)觀察 取大體組織，制作HE染色，病理切片，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：模型對(duì)照組囊腫角皮層呈多層紋理狀，生發(fā)層單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰。中等劑量組囊腫，角皮層模糊，生發(fā)層細(xì)胞數(shù)目明顯減少，結(jié)構(gòu)模糊，中-重度破壞(圖3)。低劑量組和高劑量組囊腫輕-中度破壞(表2)。

Cells’ number of the germinal layer was significantly decreased.(200×)

圖3 中劑量組治療3月后

Fig.3 After treatment with Art for 3 months, the corneous layer of the cysts is vagued

表2 小鼠細(xì)粒棘球蚴囊腫病理改變比較

Tab.2 Comparison of pathologic changes of hydatid cyst in mice

Note: Group comparison,χ2=28.570,P<0.01.

2.4 細(xì)粒棘球蚴囊腫超微結(jié)構(gòu)的觀察 與模型對(duì)照組相比，中等劑量組組織結(jié)構(gòu)破壞最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為纖維囊壁內(nèi)組織炎性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞分裂增殖，生發(fā)層細(xì)胞核模糊，甚至消失，線粒體退變，微毛蛻變(圖4)。低劑量與高劑量組，組織結(jié)構(gòu)均有不同程度的破壞。

Nucleus of the corneous layer disappeared and organelle damaged (6 000×).

圖4 中等劑量組治療3月后

Fig.4 After treatment with Art for 3 months

3 討 論

青蒿琥酯(Artesunate,Art)是半倍萜內(nèi)酯化合物青蒿素的衍生物 ,化學(xué)名為二青青蒿素-1 ,2-琥珀酸單酯,分子式為 C19O8H28,分子量384.43。2006年青蒿琥酯類藥物被世界衛(wèi)生組織定為瘧疾重癥搶救的首選藥物,它除了有效抗瘧疾作用外，尚有抗其他寄生蟲(chóng)如血吸蟲(chóng)[1]、肺孢子蟲(chóng)[2]、弓形蟲(chóng)[3]、棘球蚴[4-5]的作用，以及抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。在治療棘球蚴方面，蒲秀英等[4]研究發(fā)現(xiàn)給與小鼠每天50 mg/kg劑量的青蒿琥酯治療腹腔繼發(fā)性棘球蚴病的效果優(yōu)于每天25 mg/kg劑量的效果，而有其他研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯作為免疫調(diào)節(jié)劑，較大劑量(小鼠每天200 mg/kg)有免疫抑制作用，小劑量(小鼠每天100 mg/kg)有免疫增強(qiáng)作用[6]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)高、中、低3種劑量治療小鼠繼發(fā)性細(xì)粒棘球蚴疾病，觀察青蒿琥酯抗包蟲(chóng)效果，尋求最佳治療劑量。

為證實(shí)青蒿琥酯能否用于術(shù)中滅活頭節(jié)，本研究另外設(shè)計(jì)了滅活實(shí)驗(yàn)。體外滅活實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在原頭蚴的周圍出現(xiàn)明顯的隔離帶，可能的原因是青蒿琥酯微溶于水，易溶于碳酸氫鈉溶液，故將帶有青蒿琥酯的原頭蚴進(jìn)行伊紅染色時(shí)，水溶液被排斥而形成隔離帶，原頭蚴著色不明顯，在30 min內(nèi)不能將其快速殺死，因此，不能用于術(shù)中滅活頭節(jié)。但是Martin Spicher[5]體外培養(yǎng)，觀察青蒿琥酯的抑制頭節(jié)作用發(fā)現(xiàn)，在40 μmol/L第6 d的時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，中劑量組治療下抑囊率為68.2%，明顯高于高(12.6%)、低劑量組(51.5%)，并且病理切片以及電鏡研究表明，中等劑量組囊腫破壞最嚴(yán)重，表現(xiàn)在生發(fā)層細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞核模糊甚至消失，說(shuō)明青蒿琥酯具有良好的抗棘球蚴的作用，與蒲秀英和Martin Spicher的研究一致，但所使用劑量不同。青蒿琥酯抗其他寄生蟲(chóng)作用主要表現(xiàn)在破壞其膜系統(tǒng)，如蟲(chóng)體的細(xì)胞膜、線粒體以及核膜[6-7]，并且在細(xì)胞免疫和體液免疫均發(fā)揮了重要的作用。作為免疫調(diào)節(jié)劑，在合適的劑量下，青蒿琥酯可提高小鼠機(jī)體免疫功能，可抑制棘球蚴引起的超敏反應(yīng)，病理切片觀察，青蒿琥酯治療后的包蟲(chóng)囊腫生發(fā)層細(xì)胞數(shù)目明顯減少，結(jié)構(gòu)模糊，而中等劑量組的囊腫破壞最為嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)電鏡觀察包蟲(chóng)囊腫生發(fā)層細(xì)胞發(fā)生核溶解，線粒體退變，據(jù)此可推斷青蒿琥酯抗包蟲(chóng)病作用的機(jī)制可能為破壞其膜系統(tǒng)，減少其能量供給，阻止細(xì)胞核內(nèi)DNA的復(fù)制和逆轉(zhuǎn)錄，從而抑制包蟲(chóng)的生長(zhǎng)和繁殖。青蒿琥酯的免疫調(diào)節(jié)作用，與劑量有很大關(guān)系[8-9]，青蒿琥酯的作用機(jī)制目前研究發(fā)現(xiàn)可能與 Art阻止外鈣內(nèi)流有關(guān)通過(guò)影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響生發(fā)層細(xì)胞攝取營(yíng)養(yǎng)的作用，從而抑制包蟲(chóng)囊腫的生長(zhǎng)[10]。除此之外，青蒿琥酯具有抗纖維化的作用[11]，包蟲(chóng)囊腫的外囊的形成是棘球蚴在不斷的膨脹生長(zhǎng)過(guò)程中，包繞在周圍的肉芽腫性組織不斷纖維化的結(jié)果，最終形成排列紊亂、致密的纖維組織[12]。在包蟲(chóng)囊腫的形成過(guò)程中伴有纖維化的發(fā)生，而青蒿琥酯能夠抑制纖維化，因此包蟲(chóng)不能形成完整的囊壁，未能對(duì)棘球蚴形成良好的保護(hù)，在機(jī)體的免疫攻擊下，從而使包蟲(chóng)生長(zhǎng)受到抑制。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)中等劑量組的治療明顯好于高劑量組和低劑量組，對(duì)于小鼠來(lái)說(shuō)，用中等劑量治療，能夠更好的提高機(jī)體免疫力，發(fā)揮更好的免疫促進(jìn)作用和抗包蟲(chóng)作用。

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Effects of three dosage of artesunate on anti-echinococcosis in mice

ZHANG Hong-wei,PENG Xin-yu,WU Xiang-wei,YANG Hong-qiang,LYU Hai-long,ZHANG Shi-jie

(TheFirstAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832002,China)

To explore the therapeutic effects of high, medium and low dosage of artesunate on anti-echinococcosis of mouse, abdominal mouse model were separated into 4 treatment groups of 10 animals each. Drug suspensions were prepared in 0.5% carboxymethylcellulose (CMC) and applied as follows: 200 mg/kg/d, 100 mg/kg/d, 50 mg/kg/d and 0.9% Sodium Chloride (control group). Treatment began at the next day of inoculation. Three months later, mice were sacrificed and parasite tissue removed from the peritoneal cavity, and the parasite appearance, weight, pathologic and ultra structure changes was determined. Parasite weight was as follows: within the control--(0.044 4±0.006 27 g); 200 mg/kg/d group--(0.038 8±0.004 59 g); 100 mg/kg/d group--(0.014 1±0.003 24 g); 50 mg/kg/d group--(0.021 5±0.004 87 g). The inhibition ratio was 12.6%, 68.2%, and 51.5% respectively. All groups had pathologic and ultra structure changes. Of the total, mice in the medium dosage groups were severely damaged, which manifested as corneous layer vagued. Amount of cells in germinal layer decreased significantly. The nucleus vagued and even disappeared and mitochondria showed cataplasis, which suggested that the treatment with 100 mg/kg/d has the best effect on mouse echinococcosis.

echinococcosis; artesunate; different dosage; therapeutic effect

Zhang Shi-jie, Email: zsj-sh@tom.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81160199 )

張示杰，Email:zsj-sh@tom.com

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，石河子 832002

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.009

R383.3

A

1002-2694(2015)01-0041-04

2014-04-24；

2014-10-18

Funded by the National Natural Science Foundation of China (No. 81160199)