興奮性氨基酸及其受體與轉(zhuǎn)運(yùn)體在抗癲癇藥理學(xué)研究中的意義

廖玉芳，岳建農(nóng)，王淋麗，李 飛，李 娜，鄒 澤（重慶市黔江中心醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 409099）

癲癇是一組以腦功能陣發(fā)性、暫時(shí)性紊亂為特征的綜合征，反復(fù)發(fā)作且不可預(yù)測(cè)發(fā)病時(shí)間，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）常見(jiàn)慢性病之一[1]。近年，有關(guān)癲癇病理過(guò)程及治療方法的研究均有較大進(jìn)步。其病因?qū)W機(jī)制目前比較認(rèn)同的是“失衡”假說(shuō)，即細(xì)胞外以興奮性氨基酸（EAA）為代表的興奮性遞質(zhì)功能增強(qiáng)，或以抑制性氨基酸（IAA）為代表的抑制性遞質(zhì)的功能減弱，導(dǎo)致突觸傳遞增強(qiáng)，致使神經(jīng)元過(guò)度興奮而出現(xiàn)細(xì)胞群異常放電，從而誘發(fā)癲癇的發(fā)生發(fā)展[2]。為了闡明與EAA相關(guān)的癲癇病因?qū)W機(jī)制，筆者以“Excitatory amino acids”“Receptor”“Transporter”“Epilepsy”等為關(guān)鍵詞，在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索2004－2014 年的相關(guān)文獻(xiàn)。共得到文獻(xiàn)150 余條，對(duì)其中40條有效文獻(xiàn)歸納總結(jié)后就EAA、興奮性氨基酸受體（EAARs）、興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（EAATs）與癲癇發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及在抗癲癇藥理研究中的意義作如下綜述。

1 EAA在癲癇發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的病理生理學(xué)意義

癲癇發(fā)病機(jī)制與興奮/抑制功能失衡有關(guān)。神經(jīng)系統(tǒng)中的EAA 與IAA 類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的失衡與癲癇發(fā)作有密切聯(lián)系，它們及其各自受體異常都能引起神經(jīng)元異常放電，導(dǎo)致神經(jīng)微環(huán)路出現(xiàn)紊亂，最終誘發(fā)癲癇。EAA 主要包括谷氨酸（Glutamate，Glu）和天冬氨酸（Aspartame acid，Asp）；IAA 主要包括γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）、甘氨酸（Glycine，Gly）、牛磺酸（Taurine，Tau）、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）及α-氨基羥甲基唑丙酸（AMPA）等。在哺乳動(dòng)物CNS 中，EAA是含量最多、作用最強(qiáng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，主要貯存于突觸前神經(jīng)末梢，通過(guò)突觸前Ca2+依賴(lài)型電壓門(mén)控通道釋放，作用于突觸后膜的EAARs[3]。EAA在CNS中參與了包括從快速突觸傳遞到形成復(fù)雜的信號(hào)處理過(guò)程，如學(xué)習(xí)、記憶以及對(duì)傷害的反應(yīng)等。

EAA 水平異常升高與癲癇患者的過(guò)度興奮有著密切聯(lián)系。細(xì)胞內(nèi)外Glu 大量堆積所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞過(guò)度興奮是癲癇發(fā)作的生理基礎(chǔ)，EAA對(duì)癇性放電過(guò)程的誘導(dǎo)、擴(kuò)散及延遲起著主要作用[4]。癲癇發(fā)作時(shí)EAA/IAA比值增大、Glu和Asp水平升高、大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)的Glu免疫陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量增多[5-6]；海馬區(qū)的GABA、Tau、NMDA及AMPA含量降低，神經(jīng)元發(fā)生凋亡。這可能與EEA 引起的興奮性毒性有關(guān)[7]。由于癲癇發(fā)作時(shí)神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)間處于過(guò)度興奮狀態(tài)，據(jù)報(bào)道中央顳葉性癲癇（MTLE）發(fā)作時(shí)海馬齒狀的全細(xì)胞電流明顯增強(qiáng)[8]，同時(shí)觀察到癲癇患者神經(jīng)細(xì)胞外Glu 水平有不同程度的升高[9]。另有研究通過(guò)微量透析方式比較顳葉性癲癇（TLE）患者的硬化海馬與非硬化海馬細(xì)胞外Glu水平，發(fā)現(xiàn)發(fā)病前和發(fā)病時(shí)硬化海馬細(xì)胞外Glu 水平有所提高，尤其是在硬化海馬區(qū)，且發(fā)病后細(xì)胞外Glu仍會(huì)維持在較高水平，反映出這些神經(jīng)元過(guò)度興奮與高水平Glu的依賴(lài)性[10]。因此，下調(diào)Glu水平已成抗癲癇治療中的重要研究方向。

2 EAATs在癲癇發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生理特性及生理學(xué)意義

細(xì)胞外缺乏EAA代謝系統(tǒng)，EAA的滅活主要依賴(lài)EAATs的攝取，進(jìn)入細(xì)胞后在EAA 滅活酶作用下被滅活。在這個(gè)過(guò)程中，EAATs起著關(guān)鍵作用，根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物特異性和動(dòng)力學(xué)特性，目前已經(jīng)確定的EAATs 有5 種亞型，即EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4 和EAAT5[11]。EAATs 亞 型 之 間 有50%～60%的同源性，且EAATs 與來(lái)自于相同基因家族的ASC轉(zhuǎn)運(yùn)體間具有30%～40%的同源性[12]。EAATs是一種位于細(xì)胞膜上的糖蛋白。在CNS 中，神經(jīng)元細(xì)胞膜和膠質(zhì)細(xì)胞膜上都含有EAATs，而在EAATs亞型中EAAT1和EAAT2是主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與了前腦內(nèi)超過(guò)90%的Glu的攝取[13]；并且EAAT2 還參與了腦內(nèi)以及突觸中Glu 的攝取，攝取Glu 是EAAT2 的主要生理作用[14]。此外，還有EAAT3、EAAT4神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)體以及主要分布于視網(wǎng)膜上的EAAT5，它們均發(fā)揮著不同程度的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)Glu的作用。

EAA的轉(zhuǎn)運(yùn)異常會(huì)致使突觸間隙內(nèi)的EAA迅速聚集，不斷激活EAARs。過(guò)度激活EAARs 可促使神經(jīng)元受到病理?yè)p害，并導(dǎo)致一系列神經(jīng)性紊亂。EAA 的攝取是借助EAATs 利用跨膜電化學(xué)梯度作為驅(qū)動(dòng)力進(jìn)行的，運(yùn)轉(zhuǎn)由鈉、鉀、氫氧根的離子梯度驅(qū)動(dòng)力的推動(dòng)進(jìn)行的。Glu的再攝取速率很高，通過(guò)Glu同離子梯度的偶聯(lián)作用，EAAT1能夠逆1 000倍的濃度差轉(zhuǎn)運(yùn)Glu，Glu 經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)體再攝取進(jìn)入星形細(xì)胞后迅速轉(zhuǎn)化為無(wú)興奮活性的谷氨酰胺[15]。一旦再攝取受抑制，如當(dāng)癲癇發(fā)作時(shí)，離子梯度或膜效能降低，EAATs 則通過(guò)鈣依賴(lài)方式將Glu運(yùn)出并釋放到胞外間隙中，使胞外Glu 大量蓄積，從而過(guò)度激活谷氨酸受體（GluRs），引起興奮毒性，加重癲癇發(fā)作[16]。

EAATs低表達(dá)與癲癇發(fā)生密切相關(guān)。敲除EAAT2的大鼠腦切片顯示，細(xì)胞外Glu 含量增加并出現(xiàn)自發(fā)性癲癇，由此確定了EAATs 的功能缺失與癲癇的因果關(guān)系；在癲癇模型動(dòng)物中還顯示出EAAT1 和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（GLT-1）mRNA 和蛋白質(zhì)水平的降低，但EAAT3 變化不明顯[17]。人體試驗(yàn)的報(bào)道不多見(jiàn)，僅有少量有關(guān)癲癇轉(zhuǎn)運(yùn)體的報(bào)道[18]。通過(guò)原位雜交和Western blot 技術(shù)對(duì)TLE 患者海馬和顳葉皮質(zhì)的EAAT1 和GLT-1 表達(dá)的研究顯示，同正常對(duì)照組比沒(méi)有發(fā)現(xiàn)EAAT1 和GLT-1 mRNA 和蛋白表達(dá)增加，卻觀察到神經(jīng)元缺失區(qū)的EAAT3表達(dá)增加[19]。對(duì)海馬硬化和海馬非硬化及正常對(duì)照組的比較研究時(shí)觀察到硬化海馬中EAAT1-IR 和GLT-1-IR明顯減少，同時(shí)伴有這2種運(yùn)轉(zhuǎn)體的mRNA水平的降低；而在海馬硬化組的對(duì)應(yīng)區(qū)域中（顆粒細(xì)胞層和菌絲層）觀察到神經(jīng)元EAAT3蛋白水平的升高[20]。免疫組化和定量Western blot的研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MTLE與非MTLE在GLT-1表達(dá)上存在差異[21]。

中樞神經(jīng)紊亂與EAATs 對(duì)Glu 的吸收能力降低或潛在的功能障礙及EAATs表達(dá)下調(diào)有密切聯(lián)系[22]。多種退行性神經(jīng)性疾病，如癲癇、肌萎縮、阿爾茨海默病、帕金森綜合征等均與Glu運(yùn)轉(zhuǎn)紊亂有關(guān)。

3 EAARs在癲癇研究中的重要意義

L-Glu是最豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，介導(dǎo)哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要的興奮途徑，通常也被稱(chēng)為EAA，應(yīng)答于L-Glu 的受體稱(chēng)為EAARs[23]。EAARs 分為兩大類(lèi)：一類(lèi)為離子型受體（iGluRs），包括N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）、海人藻酸受體（KAR）和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑受體（AMPAR），它們與離子通道偶聯(lián)，形成受體-離子通道復(fù)合物，介導(dǎo)快信號(hào)傳遞；另一類(lèi)為代謝型受體（mGluRs），與膜內(nèi)G 蛋白偶聯(lián)，這些受體被激活后通過(guò)G 蛋白效應(yīng)酶、腦內(nèi)第二信使等組成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)起作用，產(chǎn)生較緩慢的生理反應(yīng)[24]。生理狀態(tài)下，EAARs僅會(huì)處于短暫的激活狀態(tài)；而在某些病理?xiàng)l件下，不適當(dāng)?shù)卮碳AARs會(huì)以興奮毒性的方式導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞損傷或缺失[25]。

興奮毒性與多種神經(jīng)性病變的病理生理學(xué)有關(guān)，包括阿爾茨海默病、舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索硬化、癲癇、焦慮癥等。其中癲癇被看作是EAA 能突觸傳遞過(guò)量所引起的神經(jīng)紊亂，給予大量Glu 或iGluRs 激活劑時(shí)可誘發(fā)癲癇模型動(dòng)物驚厥發(fā)作并引起大腦皮層及海馬組織切片的癲癇樣改變[26]。由于Glu能神經(jīng)信號(hào)在癲癇病理生理學(xué)中具有重要意義，早期有關(guān)癲癇治療的嘗試都是針對(duì)iGluRs 展開(kāi)的，并且發(fā)現(xiàn)較多iGluRs阻滯藥在很多動(dòng)物模型中能有效緩解癲癇發(fā)作，但這些藥物有著包括運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知障礙等多種副作用而未能成功應(yīng)用于臨床[27]。隨著mGluRs 的發(fā)現(xiàn)，針對(duì)GluRs 的癲癇治療方案重新受到人們的關(guān)注。mGluRs 的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于它們不負(fù)責(zé)傳遞快速突觸反應(yīng)，在突觸釋放中也很少處于活化狀態(tài)[28]。mGluRs出現(xiàn)在外部被激活的區(qū)域并起到調(diào)節(jié)作用，并且僅在神經(jīng)元被高度活化的條件下才表現(xiàn)出活性[29]。此外，鑒于mGluRs的G蛋白和第二信使的本質(zhì)，其能比iGluRs產(chǎn)生更持久的效應(yīng)[30]。由于mGluRs被活化后，仍能夠調(diào)節(jié)Glu釋放，使得mGluRs成為值得關(guān)注的治療靶點(diǎn)。

mGluRs是G蛋白偶聯(lián)受體，迄今已克隆出8個(gè)亞型，分別命名為mGluR1～mGluR8。根據(jù)氨基酸序列的同源性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及生理特性，將mGluRs 分為三類(lèi)[31]：第一類(lèi)包含mGluR1和mGluR5；第二類(lèi)包含mGluR2和mGluR3；第三類(lèi)包含mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8。組內(nèi)mGluR的氨基酸序列約有70%的同源性，不同組間僅有45%的同源性。許多試驗(yàn)表明，第三類(lèi)mGluRs的活性主要表現(xiàn)為興奮性神經(jīng)毒性，與癲癇的啟動(dòng)、傳播、維持及遲發(fā)性神經(jīng)元死亡有關(guān)。海馬內(nèi)注射高劑量或體循環(huán)給予第一類(lèi)mGluRs 激動(dòng)藥均可以導(dǎo)致大鼠驚厥發(fā)作及海馬CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞丟失[32]。第一類(lèi)mGluRs 激動(dòng)藥誘發(fā)癲癇的可能機(jī)制為：（1）激活磷酸脂酶C、促使磷酸肌醇水解、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放、增加胞漿內(nèi)Ca2+濃度，導(dǎo)致突觸后的興奮性毒性損傷；增加突觸前Glu釋放，引起突觸間隙的Glu 累積，導(dǎo)致癲癇發(fā)作。（2）通過(guò)調(diào)節(jié)第一類(lèi)mGluR 活動(dòng)，增強(qiáng)NMDA 的毒性作用。（3）促進(jìn)癲癇發(fā)生相關(guān)的蛋白和一氧化氮合成。第一類(lèi)mGluRs 阻滯藥具有一定的調(diào)節(jié)痙攣、抗驚厥的作用，但由于它們會(huì)長(zhǎng)時(shí)程阻滯小腦運(yùn)動(dòng)功能，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能障礙，故限制了第一類(lèi)mGluRs 阻滯藥的開(kāi)發(fā)潛力[33]。

激動(dòng)第二類(lèi)mGluRs可產(chǎn)生抗癲癇作用。第二類(lèi)mGluRs激動(dòng)藥可顯著提高癲癇發(fā)作閾值，有效抑制癲癇發(fā)作程度，作用機(jī)制與抑制神經(jīng)元去極化導(dǎo)致的Glu 釋放有關(guān)。第二類(lèi)mGluRs激動(dòng)藥可作為過(guò)度活躍的Glu能突觸前膜的選擇性抑制藥，并用于抗癲癇研究。在活化區(qū)域外出現(xiàn)第二類(lèi)mGluRs則可能需要更高的Glu 濃度，如癲癇發(fā)作中的受體活化過(guò)程。因此，第二類(lèi)mGluRs 激動(dòng)藥不易阻滯必要的突觸傳遞，而對(duì)于各型癲癇均顯示出確切的治療潛力，使得第二類(lèi)mGluRs成為最有開(kāi)發(fā)潛力的靶點(diǎn)，然而目前發(fā)現(xiàn)的有活性的第二類(lèi)mGluRs激動(dòng)藥都不理想。在單純激動(dòng)藥研究遇到困難時(shí)，研究者把mGluRs 的調(diào)節(jié)藥作為重要研究對(duì)象，合成的mGluR2的正變構(gòu)調(diào)節(jié)藥，只有在mGluR2激活藥或Glu存在時(shí)才能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，并對(duì)mGluR2 有特異性[34]。當(dāng)突觸與mGluR2 正變構(gòu)調(diào)節(jié)藥結(jié)合后，mGluR2功能增強(qiáng)，阻止癲癇發(fā)作。此外，mGluR2 除可作為癲癇調(diào)節(jié)靶點(diǎn)外，還與其他CNS 疾病相關(guān)，如焦慮、帕金森病和疼痛等[35]。

激活第三類(lèi)mGluRs 后通過(guò)阻滯持續(xù)活化區(qū)持續(xù)性的突觸活動(dòng)，在藥理作用上可減輕癲癇大發(fā)作，但對(duì)小發(fā)作不僅無(wú)效反而會(huì)加重發(fā)作程度。由于缺乏第三類(lèi)mGluRs 特異激動(dòng)藥，使得目前仍無(wú)法全面評(píng)估其效能。研究還發(fā)現(xiàn)，第三類(lèi)mGluRs激動(dòng)藥可增加皮層神經(jīng)元自發(fā)性活動(dòng)，可能干擾對(duì)因皮層神經(jīng)元過(guò)度興奮引起的疾病的治療。顯然，還有待于開(kāi)發(fā)高選擇性的mGluRs 激動(dòng)藥和阻滯藥以便我們更深入地研究mGluRs。

4 EAATs對(duì)癲癇治療和新藥開(kāi)發(fā)的指導(dǎo)意義

癲癇治療仍以控制癲癇發(fā)作為主要目標(biāo)。由于此病具有長(zhǎng)期性、反復(fù)性等特征，多數(shù)患者需終身服藥，治療的目標(biāo)仍在于減少或防止癲癇發(fā)作。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，仍有20%～25%的患者難以用藥物控制其反復(fù)發(fā)作。因此，在控制癲癇發(fā)作的同時(shí)控制癲癇敏感性的形成，使得降低難治性癲癇發(fā)作次數(shù)并最終完全控制成為可能。

對(duì)CNS中EAATs的研究始于20世紀(jì)80年代，早期研究主要通過(guò)定量測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)同位素標(biāo)記底物的能力，確定了Na+-K+依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)體的動(dòng)力學(xué)特性。而近年的研究則集中在高選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑的研發(fā)上?，F(xiàn)有轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑皆屬于α-氨基酸類(lèi)，其α-羧基與第2個(gè)酸性基團(tuán)間通常隔有2～4個(gè)碳原子。目前，通過(guò)對(duì)幾種含有3～5 個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)的Glu 類(lèi)似物的合成和藥理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了系列有價(jià)值的新型高效的EAAT1抑制劑，包括L-CCG-Ⅲ、L-反式-2，4-PDC、反式-ACBD和L-抗式-吲哚-MPDC[36]。這些抑制劑由于構(gòu)象變化小，所以對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體的選擇性明顯提高，與傳統(tǒng)抑制劑相比，它與GluRs 幾乎沒(méi)有交叉反應(yīng)，從而顯著降低了興奮毒性對(duì)神經(jīng)元的損傷。

早期研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑能增強(qiáng)EAA 的神經(jīng)毒性癥狀，長(zhǎng)期應(yīng)用轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑時(shí)，可誘發(fā)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病變[37]。由此可以看出，研究轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的異常與癲癇發(fā)病機(jī)制的關(guān)系具有十分重要的意義。在未來(lái)，對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型選擇性強(qiáng)效抑制劑的開(kāi)發(fā)是一個(gè)主要目標(biāo)，盡管一些已知的化合物如海人藻酸、L-α-氨基乙酸等提供了有關(guān)提高特異性的思路，但是還需要明確現(xiàn)有轉(zhuǎn)運(yùn)體與CNS中觀察到的轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)運(yùn)特性之間的關(guān)系。但隨著強(qiáng)選擇性抑制劑的出現(xiàn)使得觀察CNS各轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型在維持Glu的正常傳遞、保護(hù)神經(jīng)元免受Glu毒性影響中的作用變得更加方便。

體液中一些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子可以調(diào)節(jié)或修飾EAAT1的功能。細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C可以增強(qiáng)EAAT2和EAAT3的活性[38]。此外，一些外源性物質(zhì)，如乙醇可以增強(qiáng)EAAT3的功能，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素可以增加GLT1蛋白的表達(dá)和功能、促進(jìn)對(duì)Glu的攝取，該過(guò)程中蛋白激酶C和磷脂酰激酶3發(fā)揮了重要作用[39]。Glu 合成酶水平的下調(diào)會(huì)影響EAAT2 蛋白表達(dá)的水平，而通過(guò)這些方法可降低細(xì)胞間隙Glu、Asp 含量，使得神經(jīng)元免受興奮性毒性的損害，從而控制癲癇的反復(fù)發(fā)作，這為研制抗癲癇藥物提供了嶄新的思路和依據(jù)[40]。

5 結(jié)語(yǔ)

EAATs 和第二類(lèi)mGluRs 可能對(duì)癲癇的治療提供了新的思路，并為研制理想治療藥物提供了有益的靶標(biāo)?？梢栽O(shè)想，如果將作用于第二類(lèi)mGluRs 和EAATs 的藥物、調(diào)節(jié)第二類(lèi)mGluRs 和EAATs 的基因或者影響相應(yīng)蛋白表達(dá)的藥物應(yīng)用于臨床，將對(duì)癲癇的防治發(fā)揮積極的作用。然而第二類(lèi)mGluRs 和EAATs 在癲癇發(fā)生及其敏感性形成中的機(jī)制還不十分清楚，有待于進(jìn)一步對(duì)癲癇發(fā)生及發(fā)展的細(xì)胞和分子機(jī)制的深入研究。

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