呂春華舒展漆月黃楊波

（1，新疆維吾爾自治區(qū)阿勒泰地區(qū)動物疾病控制與診斷中心 836500；2，廣州悅洋生物技術有限公司 510300）

膠體金免疫層析技術在獸醫(yī)領域的應用

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（1，新疆維吾爾自治區(qū)阿勒泰地區(qū)動物疾病控制與診斷中心 836500；2，廣州悅洋生物技術有限公司 510300）

膠體金免疫層析技術自上個世紀面世以來就以其簡便、特異、敏感、快速無需設備和專業(yè)人員的優(yōu)點被廣泛應用于生物醫(yī)學和臨床診斷等領域，文中介紹該技術在獸醫(yī)臨床診斷和現(xiàn)場快速檢測上的發(fā)展進程，展現(xiàn)了巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應用前景。

膠體金免疫層析技術；獸醫(yī)；發(fā)展進程；應用前景；展望；綜述

膠體金免疫層析技術（Gold-immunochromatography assay，GICA）是在酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、單克隆抗體技術、膠體金技術、乳膠凝集試驗、免疫層析技術和新材料技術基礎上發(fā)展起來的一種快速、敏感的免疫檢測技術，現(xiàn)在該技術已成為繼熒光標記技術、酶標記技術和放射性同位素標記技術之后又一重要的免疫標記技術[1]。本文就將對GICA技術的發(fā)展進程、原理及其在獸醫(yī)臨床中的應用幾個方面進行介紹。

1 GICA技術的發(fā)展進程

英國著名物理學家、化學家邁克爾?法拉第在1857年首次制備出膠體金，并發(fā)現(xiàn)膠體金由紅色變?yōu)樗{色；這一重大發(fā)現(xiàn)，奠定了膠體金制備和應用的科學基礎[2]。繼1962年Feldherr等[3]首次提出將膠體金作為一種用于電子顯微鏡示蹤標記物的觀點后，1971年，F(xiàn)aulk等[4]首次將膠體金作為一種新型的有色標記物被應用于免疫學領域的研究，建立了一種以膠體金為顯示信號的免疫標記技術。免疫膠體金技術一直是國內外學者的研究重點，并得到了飛速發(fā)展。1974年建立了間接免疫金染色法，1989年建立了斑點金免疫滲濾法，1990年Beggs等在免疫滲濾技術的基礎上，建立了簡易、快速的GICA法[5]。隨著納米技術的興起和單克隆技術的成熟，GICA逐漸得到了有效完善和長足發(fā)展，現(xiàn)在在生物分子識別等生物醫(yī)學、臨床醫(yī)學診斷和獸醫(yī)領域已被廣泛應用，現(xiàn)在已有實力強勁的商品化膠體金診斷試劑盒國際化生產(chǎn)商，例如專業(yè)生產(chǎn)動物診斷檢測試劑的韓國安捷（Bionote），生產(chǎn)早孕試紙條的瑞士可麗藍（Clearblue），生產(chǎn)食品安全檢測試紙的臺灣尖端等。

2 GICA技術原理

膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在不同性質和濃度的還原劑（如鞣酸、檸檬酸三鈉、白磷、硼氫化鈉和抗壞血酸等）作用下還原而成不同粒徑的膠體金顆粒懸液，又稱金溶膠。GICA技術的原理是先將已知的抗原或抗體以條帶狀包被到硝酸-纖維素（NC）膜載體上；點樣后，樣品溶液通過濾膜的毛細作用向前移動；同時，樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體（抗體或抗原）發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域（檢測線），通過可直接目測的膠體金顆粒在短時間內聚集而得到可目測的顯色條帶。GICA和ELISA一樣可以根據(jù)膠體金標記物和包被物（捕獲材料）的不同，原理上可以細分為雙抗夾心法、間接法和競爭法等。

3 GICA在獸醫(yī)臨床中的應用

3.1 細菌性病原的檢測

在獸醫(yī)領域細菌性疾病很多并且很復雜，給臨床診斷和實驗室診斷都帶來了很多麻煩，所以學者們也將GICA技術應用到針對細菌性病原引起的動物疾病檢測方法的研究中。檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、豬鏈球菌、布魯氏菌和牛分枝桿菌等細菌的GICA檢測方法已研制成功[6]，下面筆者將著重介紹布魯氏菌病和牛結核病兩種疾病的膠體金診斷技術。

布魯氏菌?。˙rucellosis）是一種由布魯氏菌（Brucella）引起的主要侵襲生殖系統(tǒng)的人畜共患傳染病。該病是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定必須報告的動物疫病之一，我國也將其列入二類動物疫病中。近年來布魯氏菌病在我國一些地區(qū)呈現(xiàn)上升趨勢，特別是現(xiàn)在人民生活對奶制品需求的提高，促使奶牛和奶制品的貿易流通量增大，進一步擴散了疫情。有效控制布病的關鍵就是快速準確的對患病動物做出診斷并及時采取措施，所以國內外學者開展了布病GICA檢測技術的研究，并且已有獸醫(yī)技術人員在臨床上使用進口的商品化試劑盒作為現(xiàn)場診斷布病的依據(jù)。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和地方的動物疫病預防控制中心、動物衛(wèi)生監(jiān)督所等動物疫病監(jiān)測機構對GICA技術與ELISA或其他血清學檢測方法進行了試驗對比，試驗結果顯示GICA有很好的敏感性和特異性，較ELISA和其他血清學檢測方法更為快捷簡便，完全能作為現(xiàn)場診斷布病的有效工具[7-9]。

牛結核?。˙ovine Tuberculosis，bTB）是由牛結核分枝桿菌（Mycobacterium bovis）引起的一種慢性消耗性傳染病，能感染人和多種動物，嚴重危害畜牧業(yè)和人類健康。牛結核病的診斷方法以結核菌素皮試試驗為主，該方法不僅耗時長、費人力還存在很在檢測人員的判定誤差和非致病性分枝桿菌的非特異性影響；結合我國現(xiàn)在牛結核病防控的現(xiàn)狀，所以很有必要研制出一種快捷簡便、準確特異的牛結核病GICA檢測方法。2007年，張書環(huán)[10]原核表達出牛結核分枝桿菌的特異性抗原蛋白MPB83和MPB70并分別作為膠體金標記抗原和檢測線捕獲抗原，制備出牛結核病抗體檢測試紙條；此試紙條在應用中也表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能，與牛結核分枝桿菌培養(yǎng)符合率為85%，與韓國進口試紙條符合率為98.75%，與結核菌素皮試試驗符合率也高達80%。GICA技術運用到牛結核病的常規(guī)監(jiān)測中，對我國人結核病的防治也具有積極作用。

3.2 病毒性病原的檢測

在畜牧行業(yè)往往引起動物出現(xiàn)疫情的病原很多，其中很大一部分是由病毒性疾病引起的，如引起初生仔豬嚴重腹瀉死亡的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、引起禽鳥和人感染的禽流感病毒（AIV）、引起犢牛腹瀉的輪狀病毒（RV）等等。如何在眾多病原中做出科學、精確的診斷不僅需要臨床獸醫(yī)的扎實技術和豐富經(jīng)驗，還需要我們廣大科研學者提供更加準確、便捷的診斷工具，此時GICA技術就是一個有效補充，例如：規(guī)?；i場在防治仔豬腹瀉中采取初乳管理方案時，就會采用PEDV膠體金檢測卡進行病原篩查。

口蹄疫（FMD）被OIE排在A類疫病之首，我國畜牧業(yè)深受其害，現(xiàn)在有可以鑒別野毒和疫苗抗體的FMD GICA試紙條在市面上流通，為FMD的檢測防治提供了可靠手段。蔣韜等[11]還建立了O型、A型、Asia1型FMDV定型診斷膠體金免疫層析方法，該方法不與口蹄疫臨床癥狀類似的豬水泡病病毒、水泡性疹病毒、水泡性口炎病毒發(fā)生交叉反應，能檢測到7.8×104LD50的病毒量，具有良好的特異性和敏感性。

王向鵬等[12]建立了快速、簡便檢測豬瘟病毒（CSFV）野毒的GICA方法，所制備的試紙條用于檢測CSFV野毒感染的PK-15細胞培養(yǎng)物，該試紙條不與豬瘟兔化弱毒（HCLV）、豬細小病毒（PPV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒 2型（PCV-2）、偽狂犬病病毒（PRV）、PEDV和RV反應，具有良好的特異性、敏感性和重復性，初步達到了區(qū)分檢測CSFV野毒株和弱毒株的目的。

李雪松等[13]建立了檢測PRRSV的具有良好特異性、敏感性、重復性和實用性的GICA方法，為我國藍耳病的快速診斷和防制提供了技術手段。Joon T Y等[14]研制了PRV的膠體金試紙條，該試紙條檢測時只需25μL樣品，整個檢測過程僅需5min，并且與常見豬病不發(fā)生交叉反應。Kameyama K等[15]建立了快速檢測BVDV的GICA試紙條，該方法與病毒分離鑒定的敏感性和特異性分別為100%和97.2%。

在禽類疾病方面，Zhang等[16]建立了檢測雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）抗體的GICA法，彭伏虎[17]采取雙抗夾心的方法研制了新城疫病毒（NDV）GICA試紙條。徐一鳴等[18]以膠體金標記AIV H3和H7亞型單克隆抗體，以純化的馬抗H3和H7亞型AIV多抗、山羊抗鼠二抗分別包被在檢測線和質控線，制備成試紙條。該試紙條在試驗中與血凝和血凝抑制試驗、RT-PCR等檢測方法結果相符，具有良好的特異性不與其它禽類病原和AIV其它血清亞型發(fā)生交叉反應。

3.3 寄生蟲的檢測

因為大多數(shù)寄生蟲病是人獸共患疾病，所以對畜禽寄生蟲病的診斷具有重要的公共衛(wèi)生學意義。目前，文獻報道弓形蟲病、隱孢子蟲病、日本血吸蟲病、鞭蟲病、旋毛蟲病、片形吸蟲病、豬帶絳蟲病、奶牛肝片吸蟲病、羊東畢吸蟲病、犬心絲蟲病和犬弓首蛔蟲病等疾病的膠體金檢測試紙條已研制成功并應用于臨床檢測中。

張少華等[19]以膠體金標記豬帶絳蟲六鉤蚴TSOL18重組蛋白抗原，制成了豬帶絳蟲GICA診斷試紙條。該試紙條與剖檢計數(shù)法的相比敏感性為80.0%，與全囊蟲抗原ELISA的相比敏感性和特異性分別為75.0%和95.2%。王艷華等[20]研制出敏感性高于IHA，與ELISA相當?shù)臋z測弓形蟲抗體的GICA試紙條，該試紙條能檢出多種動物的弓形蟲抗體IgG和IgM，具有良好的特異性。秦銀霞等[21]建立的旋毛蟲抗體檢測試紙條，能檢出多種動物感染旋毛蟲后的陽性血清，且不與其他寄生蟲病的陽性血清產(chǎn)生交互反應。

4 展望

GICA技術從首次報道以來，一直成為國內外學者研究的熱點，通過幾十年來不斷的發(fā)展，GICA技術已廣泛應用于各個領域中，其檢測的范圍也在不斷擴大，現(xiàn)在GICA技術已用于檢測疫病、激素、毒品、藥物、重金屬等方面。獸醫(yī)領域現(xiàn)在使用GICA技術最多的是寵物醫(yī)院，獸醫(yī)對于犬瘟病毒（CDV）、犬細小病毒（CPV）、犬心絲蟲等疾病的臨床診斷主要都是參考商品化膠體金試劑盒的檢測結果。隨著獸醫(yī)檢測要求的不斷提高，未來GICA技術還應該向增大檢測范圍、提高檢測靈敏度、具有定量或半定量的功能、采用多聯(lián)方式的方向發(fā)展?，F(xiàn)階段市面上已有AIV和H7或H9亞型AIV合在一起的檢測試紙條，即一條試紙上擁有兩條檢測線；還有能根據(jù)檢測線條帶顏色深淺參照比色卡比對，起相對定量功能的試紙條。相信GICA技術依靠其快速、靈敏、特異、簡便、穩(wěn)定和不需要專業(yè)設備和專業(yè)技術人員的優(yōu)點未來必將成為獸醫(yī)技術人員現(xiàn)場診斷的首要參考工具。

[1]Frens G.Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solutions[J].Nature Physical Sicence,1973,241(105):15-20.

[2]林彤,獨軍政,叢國正,等.膠體金標記免疫層析技術的最新應用進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2010(16):8429-8431.

[3]Feldherr C M，Marshall J M.The use of colloidalgold for studies of intracellular exchanges in the ameba chaos[J].J Cell Biol,1962,12(3):640-643.

[4]Faulkw，Taylorn G M.An mimunocolloidal gold method for the electron microscope[J].Immunochemistry,1971,8:1081-1087.

[5]林一民,王云龍,胡永芳,等.膠體金免疫層析技術在臨床疾病診斷中的研究進展[J].重慶醫(yī)學,2013(1):91-93.

[6]莊金秋,梅建國,沈志強.膠體金免疫層析技術在獸醫(yī)臨床診斷中的應用進展[J].中國動物檢疫,2012(9):70-75.

[7]王楠,姚學軍,馬立峰,等.布魯氏菌病補體結合酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒敏感性和特異性評價[J].中國獸藥雜志,2014(1):2-6.

[8]郝璐,戴曉光,申捷,等.幾種布魯氏菌病檢測方法的比較[J].中國奶牛,2014(15):23-26.

[9]奚德華,羅堅強,王姣,等.全乳ELISA、血清ELISA與膠體金試驗對奶牛布魯氏菌病檢測的比較[J].畜牧與獸醫(yī),2014(12):82-84.

[10]張書環(huán).牛結核病膠體金免疫層析方法的建立與初步運用[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學,2007.

[11]蔣韜,梁仲,陳涓,等.口蹄疫病毒 O、A、AsiaⅠ型定型診斷膠體金免疫層析方法的建立[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2008(11):3801-3808.

[12]王向鵬,孫元,楊增岐.檢測豬瘟病毒野毒株膠體金免疫層析方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報,2010,32(6):441-445.

[13]李雪松,符芳,李海忠,等.快速檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金免疫層析方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報,2011,33(9):718-722.

[14]Joon Tam Y，Mohd Lila M，Bahaman A R.Development of solid-based papers trips for rapid diagnosis of pseudorabies infection[J].Trop Biomed,2004,21(2):121-134.

[15]Kameyama K，Sakoda Y，Tamai K，等.Development of an immunochromatographic test kit for rapid detection of bovine viral diarrhea virus antigen[J].Journal of Virological Methods,2006,138(1-2):140-146.

[16]Zhang J，Guo Y，Xiao Y，等.A simple and rapid strip test for detection of antibodies to avian infectious bronchitis virus[J].J Vet Med Sci,2010,72(7):883-886.

[17]彭伏虎.禽流感與新城疫膠體金免疫層析快速檢測技術及初步應用研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學,2008.

[18]徐一鳴,金寧一,楊振國,等.膠體金方法檢測H3和H7亞型禽流感病毒[J].中國獸醫(yī)學報,2009,29(5):580-583.

[19]張少華,駱學農(nóng),鄭亞東,等.豬帶絳蟲六鉤蚴TSOL18重組蛋白快速診斷試紙條研制[J].中國人獸共患病學報,2009,25(10):968-972.

[20]王艷華,李克生,才學鵬,等.弓形蟲抗體免疫膠體金快速檢測試紙條的研制[J].中國獸醫(yī)科學,2007(1):29-32.

[21]秦銀霞,崔晶,王中全.免疫層析試紙條診斷旋毛蟲病的研究[J].中國人獸共患病學報,2007,23(9):866-868.

呂春華（1958.2-），男，在職獸醫(yī)碩士，農(nóng)業(yè)推廣研究員，長期從事動物疫病防控及新技術示范應用推廣工作。中國獸醫(yī)協(xié)會第一屆、第二屆理事。最近幾年主要從事獸醫(yī)新技術應用推廣工作。主持過新疆自治區(qū)科技廳成果推廣項目3個，主持過阿勒泰地區(qū)科技推廣項目5個，阿勒泰地區(qū)重大科技項目1個，撰寫制定或參與制定阿勒泰地區(qū)地方標準10余個。目前主要從事膠體金快速檢測盒的示范應用與推廣工作。