細胞培養(yǎng)技術在中藥炮制研究中的應用

[摘要] 隨著細胞培養(yǎng)技術的不斷進步和完善，其應用領域也在不斷的擴大。近年來，細胞培養(yǎng)技術在中藥炮制研究中已得到廣泛應用，如不同炮制品之間的藥效作用比較、炮制減毒作用的研究及炮制原理的分子機制探討等。本文就細胞培養(yǎng)技術在中藥炮制研究中的應用進行綜述，并對目前研究中出現(xiàn)的問題進行分析，為細胞培養(yǎng)技術在中藥炮制研究中的深入應用提供參考。

[文獻標識碼] A

[文章編號] 1674-926X(2015)05-018-04

[作者單位] 成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 611137

[作者簡介] 李江維，女，2014級藥劑學碩士研究生，主要研究方向為中藥炮制新工藝及炮制原理研究

[通訊作者] 許潤春，女，博士，副教授，碩士生導師，主要研究方向為中藥炮制新工藝及炮制原理研究Email:309786953@qq.com

[收稿日期] 2014-12-16

Application of cell culture in the study of process of traditional Chinese Medicine Study

/LI Jiang-wei, XU Run-chun,

WANG Peng-fei //( Chengdu university of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

[Abstract] The application fields are expanding with the constant progress of cell culture technology. In recent years, cell culture technology has been widely used in the study of processing of Traditional Chinese Medicine. For example, it can be used in the comparison of effects among different processed products, toxicity attenuation research after processing, and investigation of molecular mechanism of processing theory and so on. The application of cell culture in the study of processing is reviewed and the problems in the present study are analyzed in this paper to provide reference for the further application of cell culture in the study of processing.

[Key words] Cell culture; processing of traditional Chinese Medicine; the role of processing; the theory of processing

動物細胞培養(yǎng)是指將動物活體體內(nèi)取出的組織用機械或消化的方法分散成單細胞懸液，然后放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，進行孵育培養(yǎng)，使其生存、生長并維持其結構與功能的方法 [1]。細胞培養(yǎng)技術具有簡便、準確、快捷等特點，在藥物研究領域主要用于檢測各種藥物對細胞生長的影響，通過培養(yǎng)細胞的生長曲線計數(shù)細胞增長的絕對指數(shù)，直觀地了解細胞生長與死亡的動態(tài)變化，從而反應出藥物的作用。中藥在臨床應用前，都需經(jīng)過炮制制成炮制品方能入藥。通過細胞培養(yǎng)技術可研究比較不同炮制品的藥效作用、毒性的變化及藥物的分子作用機制和炮制原理，并且可通過研究所得結果初步篩選出中藥炮制的最佳工藝條件。本文就細胞培養(yǎng)技術在中藥炮制現(xiàn)代研究中的應用作一綜述。

1　細胞培養(yǎng)技術在炮制作用研究中的應用

中藥在臨床應用前，需通過炮制加工成一定規(guī)格和質(zhì)量要求的飲片，中藥的不同炮制品，其藥性、用法、作用等均有所不同。通過細胞培養(yǎng)可在較短的時間內(nèi)比較得出中藥不同炮制品的作用，大幅提高研究效率。

徐剛等 [2]采用CCK-8法篩選出酒狗脊為最佳炮制品，其促成骨細胞增殖作用最強。陸躍鳴等 [3]采用體外培養(yǎng)腫瘤細胞的方法，直接觀察生半夏、姜浸半夏、姜煮半夏、礬半夏、姜礬半夏五種半夏炮制品中總生物堿對腫瘤細胞生長抑制作用及形態(tài)損傷作用，結果顯示姜浸半夏在低濃度時作用就較明顯，而在高濃度時礬半夏作用最明顯。吳皓等 [4]還研究半夏及其姜制抗腫瘤細胞生長作用，結果表明，姜浸半夏、礬半夏、姜礬半夏對細胞的損傷作用均較明顯，而姜浸半夏作用最強。對細胞增殖抑制作用，仍以姜浸半夏最佳。此外，周信等 [5]研究表明生半夏、清半夏、姜半夏、法半夏之間作用強度存在差異，生半夏對小鼠主動脈內(nèi)皮細胞炎性因子分泌抑制作用強于炮制品。陸平成等 [6]表明高壓炮制的藤黃對骨髓瘤細胞的殺傷作用最強，而對艾氏腹水瘤細胞則高壓制、荷葉、山羊血和水制的藤黃效果較好。對正常的腹腔巨噬細胞而言，則豆腐炮制的藤黃毒性最強。結果還提示炮制時所用的各種輔料對藤黃的細胞毒作用影響不大，影響其細胞毒作用的主要是炮制的溫度和時間。王耿等 [7]研究藤黃及其炮制品對K562腫瘤細胞生長抑制作用，結果表明生藤黃、清水煮藤黃、高壓蒸制藤黃、豆腐制藤黃、荷葉制藤黃、山羊血制藤黃對K562腫瘤細胞的生長均有抑制作用，其中高壓蒸制藤黃的抑制作用最強。易春霞等 [8]研究何首烏不同炮制品對H 2O 2致PC12細胞損傷的保護作用，與何首烏生品相比較，清蒸和黑豆汁蒸均可加強何首烏保護PC12細胞免受H 2O 2損傷的作用。王敏江等 [9]研究何首烏不同炮制品對肝細胞脂代謝的干預作用，結果表明生何首烏及何首烏傳統(tǒng)炮制品、發(fā)酵炮制品均有顯著地降脂作用，其中米根霉發(fā)酵得到的發(fā)酵品的降脂活性較好，并提示發(fā)酵法可能成為何首烏炮制法研究的新方向。焦艷等 [10]研究比較麥冬酒制前后對內(nèi)皮細胞的缺氧保護作用，結果表明麥冬酒制后更能顯著拮抗缺氧對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的損傷。李佳川等 [11]運用生物效應法從細胞途徑研究不同黃連炮制品“止消渴”藥效，結果表明黃連生品、萸制黃連、酒炙黃連、酒蒸黃連、姜制黃連、醋制黃連六種黃連炮制品均能明顯或部分降低培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，提高脂肪細胞對葡萄糖的利用率，同時在一定劑量范圍可明顯促進3T3-L1前脂肪細胞的增殖。在對3T3-L1前脂肪細胞誘導分化的影響上，各炮制品在一定劑量下抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化。其綜合作用與生品比較，萸制黃連、酒蒸黃蓮、酒炙黃連均較明顯。潘新等 [12]研究復方二神丸中補骨脂、肉豆蔻炮制后對T淋巴細胞亞群cAMP/cGMP的調(diào)節(jié)作用，結果表明補骨脂鹽炙、肉豆蔻煨炙后入藥組大鼠比補骨脂、肉豆蔻生品入藥組的恢復效果好，補骨脂和肉豆蔻在炮制后對模型大鼠的CD 3+CD 4+，CD 3+CD 8+，cAMP/cGMP調(diào)節(jié)作用增強。并提示其增強脾腎陽虛泄瀉大鼠的止瀉作用可能與調(diào)節(jié)模型大鼠的T細胞亞群和cAMP/cGMP水平的平衡有關。郭重儀等 [13]研究不同炮制方法的巴戟天對小鼠抗氧化及細胞免疫功能的影響，結果表明生曬及鹽制巴戟天均可提高淋巴細胞轉化率及NK細胞殺傷功能，從而增強細胞免疫，其生曬品比鹽制品作用效果好。徐勇等 [14]研究炒麥芽含藥血清對MMQ大鼠垂體瘤細胞增殖影響，結果表明中、高劑量組炒麥芽含藥血清對瘤細胞的增殖有抑制作用，并隨培養(yǎng)時間延長抑制作用慢慢減弱，而低劑量炒麥芽在48h前隨培養(yǎng)時間延長可促進瘤細胞增殖，48 h后這種作用發(fā)生翻轉。表明炒麥芽對垂體泌乳素腺瘤增殖具有雙重作用。李召等 [15]研究比較不同加工工藝鹿茸組分對慢性再生障礙性貧血患者骨髓造血細胞體外增殖的影響，結果表明冷工藝鹿茸對再障骨髓細胞的增殖作用明顯且優(yōu)于熱榨茸。卓麗紅 [16]等研究制何首烏對大鼠造血祖細胞增殖及骨髓細胞黏附分子表達的影響，結果表明首烏經(jīng)過蒸制后能明顯促進粒系造血祖細胞的增殖，并且能夠明顯降低骨髓抑制大鼠骨髓單個核細胞黏附分子CD54的表達。趙鳳鳴等 [17]研究山茱萸生、制品二氯甲烷萃取部位對D-半乳糖致衰人胚肺細胞影響，結果表明生山茱萸、酒制山茱萸水煎液去多糖二氯甲烷萃取部位對D-半乳糖致衰人胚肺細胞具有一定保護作用，但二者之間無顯著差異。趙青春等 [18]研究發(fā)現(xiàn)生山茱萸及酒制山茱萸二氯甲烷萃取部位對D-半乳糖致衰小鼠骨髓細胞表現(xiàn)出一定的保護作用，且酒制山茱萸二氯甲烷萃取部位保護作用更明顯。

由上可知，細胞培養(yǎng)技術可以用于中藥不同炮制品之間作用的比較，可在較短時間內(nèi)篩選出治療作用更佳的炮制品，分析出中藥炮制過程中影響藥物作用的因素，為中藥炮制方法、工藝、輔料的研究和優(yōu)化提供理論基礎。

2　細胞培養(yǎng)技術在炮制減毒研究中的應用

沈煒等 [19]研究雷公藤不同炮制品對人胚肝細胞L-O2增殖的影響，結果表明酒蒸、煅炭、醋蒸、羊血燉等方法炮制后的雷公藤對人胚肝細胞的毒性比飲片更小，并提示雷公藤可通過這4種炮制方法來降低肝臟毒性。劉偉杰等 [20]采用體外培養(yǎng)Lewis細胞，研究斑蝥酒制品對小鼠肺癌的影響，結果表明斑蝥經(jīng)酒浸泡后可在保持抗腫瘤活性基礎上降低其毒性。張麗等 [21]研究不同方法炮制甘遂對LO2細胞周期與凋亡的影響，結果表明甘遂炮制后可降低其對LO2細胞的毒性，而且甘遂醋制工藝中的炒與醋潤2種操作在醋制降低甘遂的肝毒性中能夠起到協(xié)同作用。曹雨誕等 [22]研究醋制京大戟對小腸隱窩上皮細胞的毒性，結果表明醋制可降低京大戟對腸細胞的毒性。李福全等 [23]研究蒙藥訶子湯制草烏總生物堿對乳大鼠心肌細胞的毒性作用，結果表明訶子湯炮制的草烏總生物堿對心肌細胞的毒性作用明顯低于生草烏總生物堿，由此提示采用訶子湯炮制能降低草烏的心肌毒性。

由上述可知，運用細胞培養(yǎng)技術可在短時間內(nèi)分析出不同炮制品細胞毒性作用的大小，并可根據(jù)研究結果篩選出減毒的最佳炮制方法，同時提示新的炮制減毒方法。

3　細胞培養(yǎng)技術在炮制原理研究中的應用

馮麗敏等 [24]研究醋柴胡水提液對人胚腎細胞HEK293中MRP1影響的作用機制，結果表明醋柴胡能增加胞內(nèi)MRP1轉運底物秋水仙堿的外排，但可能并非通過改變MRP1 mRNA和蛋白表達水平而實現(xiàn)。趙瑞芝等 [25]對醋柴胡小分子水溶性部位抑制HEK293-Pgp細胞中P糖蛋白的外排功能進行研究，初步探索得出醋柴胡小分子水溶性部位對P糖蛋白抑制作用具有選擇性，醋柴胡小分子水溶性部位有可能實現(xiàn)增強抗癌藥療效的作用，且作用位點可能在基因水平，提示醋柴胡引經(jīng)作用的位點可能在基因水平。陳海鷹等 [26]研究醋制降低京大戟對人正常肝細胞LO2的毒性機制。結果表明其減毒機制可能是減輕細胞氧化損傷，從而降低細胞周期阻滯，減少細胞凋亡，為進一步闡明京大戟醋制減毒的機制提供了依據(jù)。顏曉靜等 [27]采用體外培養(yǎng)脾淋巴細胞、腹腔巨噬細胞，初步探討甘遂醋炙減毒機制。研究結果提示在甘遂醋炙過程中加熱和醋潤兩個炮制程序能夠起到降低甘遂致炎毒性的協(xié)同作用，為探討甘遂醋炙減毒機制提供了一定的依據(jù)。唐丹霞等 [28]研究厚樸汁炙遠志含藥血清對胃Cajal 間質(zhì)細胞活力及nNOS表達的影響，結果表明厚樸汁炙遠志炮制品緩解胃動力障礙的分子生物學機制，可能與下調(diào)胃Cajal 間質(zhì)細胞胞內(nèi)nNOS，促進胃Cajal 間質(zhì)細胞活力有關。吳有蓮等 [29]研究了制何首烏對成骨細胞的作用機理，結果表明其作用機理可能與上調(diào)成骨細胞成骨相關基因的表達有關。李淑雯等 [30]研究香附醋制前后對Caco-2細胞P-糖蛋白功能和表達的影響，結果顯示香附醋制后對P-糖蛋白的功能和表達呈現(xiàn)出抑制作用，由此說明柴胡醋制增效的機理可能是抑制P-糖蛋白對藥物的外排，從而增加藥物濃度，提高藥效。余小華等 [31]研究炒麥芽含藥血清對MMQ大鼠垂體瘤細胞NGF、PRL分泌表達的影響，結果顯示低劑量炒麥芽和中劑量炒麥芽均可以促進NGF少量分泌，此時NGF與受體trkA結合而使垂體瘤細胞PRL激素的分泌增加，而大劑量炒麥芽含藥血清干預垂體瘤細胞時NGF分泌量較大，NGF則與P75受體結合，從而啟動誘導垂體瘤細胞凋亡過程，進而抑制PRL激素的分泌。由此說明炒麥芽可能是通過上調(diào)NGF的分泌進而抑制PRL激素的分泌。唐丹霞等 [32]研究厚樸汁炙遠志對小鼠胃Cajal 間質(zhì)細胞Ca 2+通道的影響，結果顯示厚樸汁炙遠志炮制品能明顯緩解遠志對正常小鼠胃Cajal 細胞Ca 2+通道損傷，維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)，提高細胞活力，其機制可能是升高細胞外液Ca 2+量、減弱對ATP酶活力的影響及降低胃間質(zhì)細胞內(nèi)1，4，5-三磷酸肌醇水平，起到緩解因遠志導致胃腸動力紊亂所致的胃動力障礙。

4　細胞培養(yǎng)技術在中藥炮制研究其他方面的應用

細胞培養(yǎng)技術在中藥炮制品作用研究中的應用除上述三個方面，也應用在炮制品有效成分或有效提取部位的篩選。于海濤等 [33]對狗脊炮制品中促進成骨細胞增殖分化的成分進行了篩選。鞠成國等 [34]研究狗脊生、制品不同提取部位對成骨細胞的影響，結果表明狗脊正丁醇提取部位對細胞增殖作用最明顯。通過對炮制品有效成分和有效提取部位的研究，也可為研究中藥炮制的新方法提供參考依據(jù)。此外，王萬根等 [35]研究何首烏高壓蒸制法蒸制時間對何首烏抗衰老活性影響，在壓力為150 kPa，溫度為121℃的條件下分別加壓炮制1 h、2 h、3 h、4 h，最后篩選出高壓蒸制法炮制何首烏的最佳炮制時間為3 h。

5　結論與討論

與動物整體作為研究對象比較，細胞培養(yǎng)技術具有準確控制藥物作用對象、時間、劑量以及細胞生長條件的優(yōu)點，可直接觀察藥物對細胞形態(tài)結構和生命活動的影響，在大型動物作為研究對象時，還具有耗資少的優(yōu)點。此外該技術還具有實驗周期短、操作簡單、結果可靠等特點。

綜上所述，細胞培養(yǎng)技術在中藥炮制增效、減毒以及炮制原理研究等方面已得到廣泛的應用，在炮制工藝研究方面也有報道，為中藥炮制的現(xiàn)代化研究注入了新的生機。目前細胞大多是在一種有限的二維的生長空間內(nèi)培養(yǎng)，在此條件下雖然可使細胞維持生長、繁殖，但相對于機體這個系統(tǒng)來講，仍存在很大的差異，所以由此研究所得結果不能等同于在體內(nèi)研究的結果。隨著細胞培養(yǎng)技術的不斷進步和完善，細胞培養(yǎng)體系已從二維發(fā)展到三維，三維細胞培養(yǎng)技術中細胞生長的生理微環(huán)境與機體內(nèi)細胞生長的生理微環(huán)境更加相近，研究結果更加接近體內(nèi)研究結果，因此更具參考價值?？蛇\用三維細胞培養(yǎng)技術研究炮制對中藥藥效的影響，以避免實驗療效顯著而臨床效果下降的現(xiàn)象，篩選出治療效果顯著的炮制品和更加優(yōu)異炮制條件及可靠的炮制方法，從而指導優(yōu)化炮制條件，指示新的炮制方法。也可用于研究細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用對藥物作用的影響，進一步闡明藥物作用機制，為研究炮制增效減毒等傳統(tǒng)的炮制理論奠定基礎。