谷胱甘肽對(duì)育肥羊機(jī)體抗氧化能力的影響

■姜 寧 楊 坤 張愛(ài)忠 宋增廷 劉守江, 齊永生 張東峰

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司，廣東湛江 524094；3.大慶紅色草原牧業(yè)有限公司，黑龍江大慶 163412）

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是廣泛分布于哺乳動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞內(nèi)最主要、含量最豐富的含巰基的低分子肽。GSH在生物體內(nèi)有著多種重要的生理功能，特別是對(duì)于維持生物體內(nèi)適宜的氧化還原環(huán)境起著至關(guān)重要的作用，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)參與對(duì)異物、親電代謝物的去毒，是有效的自由基清除劑，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧復(fù)合物的損傷。GSH可以作為促生長(zhǎng)劑促進(jìn)仔豬、黃羽肉雞和育肥羊的生長(zhǎng)；其抗氧化作用的研究主要在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域居多，如劉曉華等對(duì)初始體質(zhì)量約1 g的凡納濱對(duì)蝦(L.vannamei)添加GSH，可提高其肝胰腺的抗氧化能力(GSH-Px、谷胱甘肽還原酶、SOD)及降低脂質(zhì)過(guò)氧化物(MDA)含量；梁春梅對(duì)平均體質(zhì)量3 g左右的奧尼羅非魚(yú)(O.niloti?cus×O.aureus)的試驗(yàn)結(jié)果表明，在純化飼料基礎(chǔ)上添加一定量的GSH可提高羅非魚(yú)血清中GSH-Px、谷胱甘肽還原酶活力，并提高肝組織谷胱甘肽還原酶活力，增強(qiáng)魚(yú)體抗氧化能力；朱選在草魚(yú)基礎(chǔ)日糧中添加不同劑量的谷胱甘肽，能夠促進(jìn)草魚(yú)肝臟和肌肉中GSH的沉積，提高肝臟及肌肉中谷胱甘肽還原酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活力，以及肝臟中GSH-Px和SOD活力與總抗氧化能力，減少肝臟中MDA含量，降低肝臟及血清中活性氧含量。GSH對(duì)反芻動(dòng)物的抗氧化作用鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)在育肥羊日糧中添加谷胱甘肽，并通過(guò)對(duì)血清中相關(guān)抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)，來(lái)觀察谷胱甘肽對(duì)育肥羊機(jī)體抗氧化能力的影響，為其在反芻動(dòng)物上的應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與日糧

試驗(yàn)選用3月齡東北細(xì)毛羊×德國(guó)肉用美利奴的雜交一代綿羊12只，采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，根據(jù)供試羊血緣關(guān)系相近、體重相似和性別相同原則，將12只育肥羊分為3組，每組4個(gè)重復(fù)，公母各占1/2?；A(chǔ)日糧的配制參考綿羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（GB：NY/T816-2004），日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)1組和2組在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加500 mg/kg、800 mg/kg的GSH（還原型，購(gòu)于日本W(wǎng)A?KO公司，貨號(hào)為141730，純度為98.5%）。飼養(yǎng)試驗(yàn)預(yù)飼期為15 d，正試期為60 d。預(yù)飼期內(nèi)，進(jìn)行常規(guī)消毒和驅(qū)蟲(chóng)。供試羊只單欄飼養(yǎng)，每天8:00、18:00飼喂2次精料補(bǔ)充料和青干草，自由飲水。GSH在飼喂時(shí)加入到精料補(bǔ)充料中，充分混勻。

1.2 樣品采集與處理

分別于飼養(yǎng)試驗(yàn)的正試期前1 d（記為0 d）、正試期的20、40和60 d晨飼前頸靜脈采血10 ml，置于20 ml離心管中，傾斜45°室溫凈置1 h，3 500 r/min離心15 min制備血清。將血清分裝在EP管中，24 h內(nèi)測(cè)定GSH-Px和CAT，其余血清置于-20℃待測(cè)其它抗氧化指標(biāo)。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

血清丙二醛(MDA)根據(jù)硫代巴比妥酸法(TBA)進(jìn)行比色定量測(cè)定；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法；過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定采用鉬酸銨絡(luò)合法；血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPx)活性采用二硫代硝基苯甲酸法(DTNB)測(cè)定；血清總抗氧化能力（T-AOC）采用菲啉法進(jìn)行定量測(cè)定。所有試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。測(cè)定儀器為723A可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。用ANO?VA程序進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較。結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析(見(jiàn)表2)

2.1 谷胱甘肽對(duì)育肥羊血清丙二醛的影響

由表2可知，試驗(yàn)期內(nèi)育肥羊血清中的MDA濃度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在20 d時(shí)達(dá)到最高值，各處理組間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)；40 d時(shí)兩試驗(yàn)組血清中的MDA濃度均極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；60 d時(shí)兩試驗(yàn)組MDA含量仍顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.2 谷胱甘肽對(duì)育肥羊血清超氧化物歧化酶的影響

由表2可見(jiàn)，整個(gè)試驗(yàn)期，對(duì)照組肉羊的血清超氧化物歧化酶的含量比較穩(wěn)定，試驗(yàn)1組在40 d時(shí)開(kāi)始升高，試驗(yàn)2組則在20 d略有升高后轉(zhuǎn)而下降。試驗(yàn)各時(shí)期，試驗(yàn)1組和2組與對(duì)照組育肥羊的血清SOD的含量比較均沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），僅在20 d時(shí)，試驗(yàn)2組的血清SOD的含量顯著高于試驗(yàn)1組（P＜0.05），但試驗(yàn)后期試驗(yàn)2組的SOD的水平迅速下降，60 d時(shí)低于其它兩組（P＞0.05）。

表2 谷胱甘肽對(duì)育肥羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 谷胱甘肽對(duì)育肥羊血清過(guò)氧化氫酶的影響

由表2可知，隨著育肥羊日齡的增長(zhǎng)，血清中過(guò)氧化氫酶的活性逐漸升高，添加GSH后育肥羊血清CAT的活性明顯提高。20 d時(shí)，兩試驗(yàn)組血清中CAT的活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；試驗(yàn)40 d時(shí)，試驗(yàn)2組血清中CAT的活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)1組也略高于對(duì)照組（P＞0.05）。60 d時(shí)，試驗(yàn)1組血清中CAT的活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而試驗(yàn)2組較對(duì)照組略有提高（P＞0.05）。

2.4 谷胱甘肽對(duì)育肥羊血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的影響

整個(gè)試驗(yàn)期，兩試驗(yàn)組的血清中GSH-Px活性均逐漸升高，對(duì)照組在試驗(yàn)20 d時(shí)略有降低，之后逐漸升高。試驗(yàn)初期，各處理組間血清中GSH-Px活性沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。試驗(yàn)20 d時(shí)，兩試驗(yàn)組GSHPx活性均較對(duì)照組有所提高（P＞0.05）；試驗(yàn)40 d時(shí)，試驗(yàn)2組血清中GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)1組也略高于對(duì)照組（P＞0.05）。到60 d時(shí)，試驗(yàn)1組育肥羊血清中GSH-Px的活性極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），試驗(yàn)2組也高于對(duì)照組（P＞0.05）。

2.5 谷胱甘肽對(duì)育肥羊血清總抗氧化能力的影響

試驗(yàn)期內(nèi)，各處理組育肥羊的總抗氧化能力均逐漸增強(qiáng)，添加GSH不同程度地提高了育肥羊的總抗氧化能力。試驗(yàn)20、40 d時(shí)，兩試驗(yàn)組的總抗氧化能力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），并且試驗(yàn)2組顯著高于試驗(yàn)1組（P＜0.05）；60 d時(shí)，兩試驗(yàn)組的總抗氧化能力仍高于對(duì)照組（P＞0.05），且兩試驗(yàn)組間無(wú)顯著差異（P＜0.05）。

3 討論

動(dòng)物機(jī)體內(nèi)有一套完整的抗氧化系統(tǒng)，在正常生理?xiàng)l件下，自由基不斷生成，又不斷被清除，從而維持相對(duì)的平衡。當(dāng)自由基的生成超過(guò)機(jī)體抗氧化物質(zhì)的清除能力時(shí)，過(guò)量的自由基會(huì)在體內(nèi)積聚并參與一系列連鎖反應(yīng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用。自由基可攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，如醛基、酮基等。丙二醛（MDA）為脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其濃度可間接反映機(jī)體的脂質(zhì)抗氧化水平，也間接反映細(xì)胞損傷的程度。本試驗(yàn)各處理組在試驗(yàn)初期（20 d）血清中MDA均有上升，之后又有所降低，可能與試驗(yàn)初期育肥羊由散放改為單欄飼養(yǎng)受到一定程度應(yīng)激有關(guān)。但所測(cè)得的血清MDA的濃度為2.61～6.24 nmol/ml，這與以前的試驗(yàn)結(jié)果相似，說(shuō)明試驗(yàn)羊仍處于相對(duì)正常的抗氧化狀態(tài)。試驗(yàn)結(jié)果表明，外源GSH可顯著降低試驗(yàn)后期血清中MDA的濃度，有效降低育肥羊機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。劉平祥等（2002）研究表明，添加GSH對(duì)仔豬血清中MDA水平無(wú)顯著影響，但可以顯著降低小腸黏膜MDA水平；劉曉華（2007）在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加不同劑量的GSH，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)各組肝胰腺M(fèi)DA含量顯著降低(P＜0.05)；朱選等（2008）在草魚(yú)飼料中添加GSH的研究表明，肝臟和肌肉中MDA在GSH添加水平為300 mg/kg組達(dá)到最低，顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，本研究中添加GSH對(duì)0～20 d羊血清中MDA 影響不顯著(P＞0.05)。

SOD廣泛存在于動(dòng)植物、微生物中，是一種有效的抗氧化劑，能催化O2-·發(fā)生歧化反應(yīng)，故能抵御其對(duì)細(xì)胞的破壞作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加800 mg/kg的GSH提高了試驗(yàn)前期育肥羊血清中SOD水平，這與張國(guó)良等（2007）在羅非魚(yú)上研究結(jié)果一致。然而，本試驗(yàn)后期高劑量的GSH卻降低了SOD的水平，這可能是因?yàn)槌掷m(xù)高劑量的外源GSH通過(guò)直接清除多余的自由基，體內(nèi)的應(yīng)激減少，從而不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)多的GSH-Px。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶，可催化GSH清除過(guò)氧化氫和脂質(zhì)過(guò)氧化物，抑制自由基的生成。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼料中添加GSH，育肥羊血清中GSH-Px活性逐漸增強(qiáng)，這與吳覺(jué)文（2003）[5]在黃羽肉雞上的試驗(yàn)結(jié)果一致。添加GSH提高了血清中的GSH的水平，底物的增加可能對(duì)GSH-Px具有刺激作用，使其活性增強(qiáng)；GSH-Px的活性增強(qiáng)也可能與GSH促進(jìn)硒的吸收有關(guān)，因?yàn)槲荊SH-Px的一種成分，硒的水平可直接影響GSH-Px活力的發(fā)揮。而Senn E等（1992）體內(nèi)試驗(yàn)表明GSH能促進(jìn)亞硒酸鹽形式硒在小鼠腸道內(nèi)的吸收。

與GSH-Px一樣，過(guò)氧化氫酶（CAT）廣泛分布于各種組織中。CAT的主要作用是催化H2O2分解成H2O和O2，使得H2O2不致于與O2-·在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成對(duì)機(jī)體有害的·OH，因此CAT在分解H2O2時(shí)往往與GSH-Px存在協(xié)同作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加GSH后，育肥羊血清CAT的活性在20 d時(shí)顯著高于對(duì)照組，在40、60 d時(shí)血清中CAT的活性仍高于對(duì)照組，表明外源GSH在短期內(nèi)即可發(fā)揮抗氧化作用，且抗氧化效果持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。

T-AOC是機(jī)體抗氧化能力強(qiáng)弱和健康程度的綜合體現(xiàn)，T-AOC的大小可代表和反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對(duì)外來(lái)刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝的狀態(tài)，是反映機(jī)體抗氧化功能的一個(gè)良好指標(biāo)。本試驗(yàn)中，各處理組在試驗(yàn)期間血清T-AOC均不同程度的高于對(duì)照組，這說(shuō)明外源GSH能夠提高育肥羊機(jī)體的抗氧化能力，這與以前在仔豬、肉雞以及羅非魚(yú)[8,18]、草魚(yú)[9]等動(dòng)物中的報(bào)道結(jié)果一致。

4 結(jié)論

①500 mg/kg的GSH顯著降低了育肥羊試驗(yàn)40 d（P＜0.01）和60 d（P＜0.05）血清中MDA的含量；顯著提高了20 d和60 d時(shí)育肥羊血清中CAT的活性（P＜0.05）；顯著提高了60 d時(shí)育肥羊血清中GSH-Px的活性（P＜0.01）和試驗(yàn)20 d（P＜0.01）、40 d（P＜0.05）的總抗氧化能力。

②800 mg/kg的GSH顯著降低了育肥羊試驗(yàn)40 d（P＜0.01）和60 d（P＜0.05）血清中MDA的含量；顯著提高了試驗(yàn)20 d、40 d育肥羊血清中CAT的活性（P＜0.05）和40 d育肥羊血清中GSH-Px的活性（P＜0.05），以及試驗(yàn)20 d（P＜0.01）、40 d（P＜0.05）的總抗氧化能力。

③盡管GSH對(duì)育肥羊的抗氧化作用隨其添加劑量的提高而增強(qiáng)，但從經(jīng)濟(jì)效益的角度出發(fā)，飼料中添加500 mg/kg的GSH即可達(dá)到提高育肥羊抗氧化能力的目的。

（參考文獻(xiàn)20篇，刊略，需者可函索）