梅毒疫苗發(fā)展的需求、挑戰(zhàn)與前景

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(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001)

·文獻(xiàn)綜述·

梅毒疫苗發(fā)展的需求、挑戰(zhàn)與前景

朱洪，江銀波，余堅(jiān)，曾鐵兵*

(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001)

梅毒是由蒼白密螺旋體蒼白亞種即梅毒螺旋體(Tp)引起的一種性傳播疾病，盡管可被廉價(jià)有效的抗生素治愈，但依然在發(fā)展中國(guó)家流行和發(fā)達(dá)國(guó)家再現(xiàn)，嚴(yán)重危害公眾健康。感染性梅毒給全球帶來(lái)醫(yī)療負(fù)擔(dān)，先天性梅毒被認(rèn)為是影響全球胎兒和新生兒最重要的感染性疾病，梅毒感染還會(huì)增加感染和傳播艾滋病的風(fēng)險(xiǎn)。全球梅毒的高發(fā)和防治該病的失敗，使得對(duì)梅毒疫苗的需求迫在眉睫。在動(dòng)物模型中用γ射線(xiàn)致弱的Tp長(zhǎng)期免疫動(dòng)物獲得了完全保護(hù)，提示了發(fā)展梅毒疫苗的可行性及Tp外膜表面成分在誘導(dǎo)免疫保護(hù)中的重要性。梅毒適宜發(fā)展疫苗用于防治，但實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)前需要解決好參與人員、研究以及市場(chǎng)問(wèn)題。

梅毒； 蒼白密螺旋體； 疫苗； 外膜蛋白

梅毒是梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)導(dǎo)致的一種慢性性傳播疾病(STD)。感染性梅毒是全球流行的一種威脅公眾健康的疾病，WHO估計(jì)全球有3600萬(wàn)感染者和每年超過(guò)1100萬(wàn)的新增患者[1]，其中超過(guò)90%的病例在發(fā)展中國(guó)家，近年許多發(fā)達(dá)國(guó)家再次出現(xiàn)。中國(guó)梅毒近年來(lái)發(fā)病數(shù)呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，以先天梅毒和男—男同性接觸(MSM)伴艾滋病性梅毒增長(zhǎng)[2]尤為明顯。先天性梅毒在低收入國(guó)家被認(rèn)為是與流產(chǎn)和死產(chǎn)的最相關(guān)因素，每年有50多萬(wàn)例先天性梅毒出現(xiàn)[3]。有癥狀的梅毒感染能提高2至5倍感染和傳播艾滋病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。梅毒疫情和危害已成為中國(guó)乃至全球高度關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題，中國(guó)政府出臺(tái)了《中國(guó)預(yù)防與控制梅毒規(guī)劃(2010～2020年)》以遏制梅毒疫情的蔓延[5]。

青霉素治療梅毒感染已有70余年，至今Tp對(duì)其仍十分敏感，引發(fā)了是否需要研發(fā)梅毒疫苗的強(qiáng)烈爭(zhēng)議。盡管有集中控制梅毒的舉措和廉價(jià)有效治療梅毒的藥物，但全球梅毒感染率仍持續(xù)升高，而且青霉素的二線(xiàn)替代藥物如大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的耐藥性已在許多國(guó)家出現(xiàn)，以至于被拒絕用于治療和預(yù)防梅毒。因此，控制梅毒不能僅僅依靠篩選和治療梅毒，迫切需要發(fā)展和使用梅毒疫苗作為補(bǔ)充，而前提是需要深入研究梅毒發(fā)病機(jī)制和篩選確定梅毒疫苗靶抗原。有效梅毒疫苗研發(fā)成功，將明顯降低成人梅毒及先天性梅毒的發(fā)生率，有效控制梅毒對(duì)艾滋病的防御也具有顯著積極的影響。

1 梅毒發(fā)病機(jī)制

1.1 Tp生物學(xué)特征Tp屬于螺旋體科密螺旋體屬，人是Tp的唯一宿主。1998年，Tp(Nichols株)全基因組被測(cè)序，在隨后的測(cè)序中發(fā)現(xiàn)密螺旋體亞種間基因序列同源性高達(dá)99.8%以上[6]。Tp是一類(lèi)生物學(xué)性狀十分獨(dú)特的原核細(xì)胞型微生物[7]：(1)缺乏代謝酶，不能像大多原核細(xì)胞微生物一樣體外人工培養(yǎng)；(2)有28%基因與其它物種無(wú)同源性，為新基因；(3)不可培養(yǎng)和不可進(jìn)行遺傳操作(基因敲入或敲出)；(4)外膜蛋白(OMP)十分稀少，僅為大腸埃希菌的百分之一，缺乏敏感的鑒定方法，而且外膜十分脆弱，鑒定OMP十分困難；(5)雖為革蘭陰性菌卻缺乏脂多糖(內(nèi)毒素)和III型分泌系統(tǒng)、菌毛及莢膜，也不產(chǎn)生明顯的外毒素。Tp這些特殊的生物學(xué)性狀是阻礙研究Tp致病機(jī)制和疫苗的主要原因。

1.2梅毒的自然感染史自然情況下未經(jīng)治療的梅毒會(huì)出現(xiàn)第一階段的硬下疳和第二階段的散發(fā)性皮疹。隨后是無(wú)癥狀潛伏期，該期會(huì)在大多數(shù)人中持續(xù)一段時(shí)間。在無(wú)抗生素的時(shí)代，約30%的個(gè)體會(huì)在10～50年后發(fā)展為三期梅毒并對(duì)其威脅生命。梅毒自然發(fā)展過(guò)程有利于洞察Tp建立和維持感染的發(fā)病機(jī)制。高度的侵襲力和免疫逃避形成持續(xù)感染的能力是Tp生存的兩個(gè)必要因素。

1.2.1 Tp的高度侵襲能力 Tp通過(guò)胎盤(pán)傳播導(dǎo)致先天性梅毒，至少40%的早期梅毒患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到過(guò)Tp侵襲，二期梅毒出現(xiàn)廣泛皮疹和導(dǎo)致肝、腎及眼部癥狀，這些都表明Tp具有高度侵襲力[7]。Tp在感染動(dòng)物數(shù)小時(shí)內(nèi)，可通過(guò)血液和淋巴播散[7]。體外實(shí)驗(yàn)也顯示Tp可以穿透完整的膜和內(nèi)皮細(xì)胞層[7]。Tp入侵組織后只能附著在細(xì)胞上(如毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞)。Tp0136[8]、Tp0155、Tp0483[9]和Tp0751[10-12]幾個(gè)蛋白能以細(xì)胞外基質(zhì)為橋梁吸附宿主細(xì)胞。Tp的侵襲能力對(duì)形成臨床表現(xiàn)至關(guān)重要，消除這種能力將防止傳染性梅毒的傳播、先天性梅毒的形成和個(gè)體梅毒的感染進(jìn)程，是發(fā)展梅毒疫苗的中心環(huán)節(jié)。

1.2.2 梅毒早期病變的消除 一期和二期梅毒病變主要有T細(xì)胞浸潤(rùn)，隨后為巨噬細(xì)胞(Mφ)。Mφ浸潤(rùn)后不久清除絕大多數(shù)Tp。Th1型細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素募集并激活Mφ使其能吞噬抗體調(diào)理的螺旋體并將其殺滅。大部分Tp被清除但仍然會(huì)有一部分Tp存在，這些局部殘留的Tp能抵抗Mφ的調(diào)理吞噬作用，Tp的免疫逃逸對(duì)形成梅毒終生慢性感染至關(guān)重要。

1.2.3 Tp持久感染的原因 在梅毒感染早期癥狀自發(fā)消除后，進(jìn)入一段無(wú)癥狀慢性感染時(shí)期，稱(chēng)之為“潛伏期”。Tp這種持續(xù)生存能力可能與下列因素有關(guān)：(1)Tp隱藏在“免疫豁免”部位如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼睛或除吞噬細(xì)胞外的其它細(xì)胞內(nèi)；(2)Tp外膜蛋白稀少，抗原靶位有限，在梅毒逃逸免疫應(yīng)答中起重要作用；(3)Tp表面的Tpr家族蛋白抗原的多樣性和變異性[13-14]。最近發(fā)現(xiàn)Tp存在兩種抗原類(lèi)型變異：①通過(guò)改變基因啟動(dòng)子區(qū)域的polyG長(zhǎng)度，階段性表達(dá)或不表達(dá)TprE、TprG和TprJ[15]；②TprK分散區(qū)域序列在密螺旋體亞種間、Tp株間甚至株內(nèi)的變異[16]。Tpr家族的TprC和TprD都在其株間和亞種間存在異質(zhì)性，但TprC和TprD序列在感染過(guò)程中卻似乎保持不變。這些多變的區(qū)域預(yù)測(cè)為表面結(jié)構(gòu)[17]，并且認(rèn)為T(mén)prC是抗體調(diào)理素的靶位[13]，這有助于部分解釋人多次感染梅毒可能是因?yàn)椴煌瓯磉_(dá)不同的TprC和TprD序列。發(fā)展疫苗時(shí)需要考慮抗原變異性，應(yīng)集中針對(duì)這些重要蛋白抗原的恒定區(qū)。

1.3 Tp研究中的技術(shù)難題阻礙了Tp外膜蛋白的鑒定Tp不可人工培養(yǎng)和遺傳操縱、OMP稀少、外膜脆弱等因素阻礙了對(duì)其OMP的鑒定。為了避免這些限制，研究者應(yīng)用生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[13,18]等方法，證明了一些蛋白具有功能活性如對(duì)宿主成分粘附作用[8-12]、抗體調(diào)理素的靶位[19-20]、抗原變異[14]等。至今為止鑒定的候選表面外膜蛋白主要包括：粘附素Tp0136、Tp0155、Tp0483和Tp0751[8-12]；Tpr家族蛋白中TprK(Tp0897)[14]、TprC/D(Tp0117/131)[13,17]、TprI(Tp0620)與TprF(Tp0316)[21]；Tp92(Tp0326)[22]；Tp0966-Tp0969[23]。這些都是重要的梅毒疫苗的候選分子。

2 梅毒動(dòng)物模型

雖然有些哺乳動(dòng)物能夠感染Tp，但極少會(huì)發(fā)展為臨床疾病。兔是唯一能出現(xiàn)人類(lèi)梅毒感染多個(gè)階段和慢性特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)室小型動(dòng)物，適宜用做研究梅毒致病機(jī)制和免疫機(jī)制的動(dòng)物模型。過(guò)去的數(shù)十年中，均采用新西蘭兔進(jìn)行梅毒研究，但由于不能獲得近交系株和缺乏兔免疫檢測(cè)試劑，限制了兔模型的免疫學(xué)研究。近年來(lái)，建立了一些檢測(cè)兔細(xì)胞因子的方法，但需發(fā)展更多的檢測(cè)方法。

3 Tp天然表面抗原是疫苗的關(guān)鍵成分

3.1理論依據(jù)1973年Miller在37周內(nèi)給新西蘭兔靜脈注射經(jīng)γ射線(xiàn)致弱的Tp，獲得了長(zhǎng)達(dá)一年抗同株Tp攻擊的完全保護(hù)。盡管這種免疫方案不適合用于人類(lèi)，但該研究具有開(kāi)創(chuàng)性意義，建立了理論上完全保護(hù)的動(dòng)物模型，同時(shí)深刻認(rèn)識(shí)到Tp表面抗原對(duì)保護(hù)作用起著決定性作用。使用滅活疫苗失敗是由于用物理或化學(xué)處理Tp時(shí)破壞了其表面不穩(wěn)定的抗原。雖然大多數(shù)研究者將焦點(diǎn)集中于Tp的OMP上，但需要提醒的是Tp的表面膜含有脂質(zhì)，Miller所使用的免疫原中包含了這些脂類(lèi)抗原，用其免疫兔可產(chǎn)生調(diào)理素抗體獲得部分保護(hù)性。此外，全Tp免疫小鼠可產(chǎn)生高度中和作用的單克隆抗體，該抗體能特異性結(jié)合Tp磷酸膽堿抗原表位，被動(dòng)轉(zhuǎn)移該抗體能顯著降低Tp感染[24]。

3.2延長(zhǎng)形成保護(hù)的時(shí)間Miller用γ射線(xiàn)致弱的無(wú)繁殖力的Tp靜脈注射新西蘭兔獲得完全保護(hù)需要37周，而免疫24周和12周僅分別獲得部分保護(hù)或不能免疫保護(hù)。Miller的研究也證實(shí)了之前的觀(guān)察，即動(dòng)物模型內(nèi)的免疫保護(hù)可防止同源Tp的再感染。抵抗有癥狀的同源株Tp感染的完全保護(hù)僅在Tp感染12周后才會(huì)出現(xiàn)。如果兔前12周階段受到感染得到治愈，可以在12周后再次被感染?，F(xiàn)在推測(cè)這種免疫保護(hù)緩慢的變化與Tp細(xì)菌上特殊的表面蛋白稀少有關(guān)。這些觀(guān)察結(jié)果，結(jié)合Miller的保護(hù)性研究，表明表面抗原在有效梅毒疫苗中的重要性，是有效疫苗的靶抗原成分。

4 免疫保護(hù)的相關(guān)因素

4.1兔感染模型中的免疫保護(hù)相關(guān)因素感染過(guò)程中，病變處先出現(xiàn)Th1細(xì)胞應(yīng)答，隨后為抗體調(diào)理Mφ吞噬殺死而清除Tp。單獨(dú)的抗體并不能消除Tp感染，T細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移只能短暫且不完全抵抗感染。從過(guò)去疫苗研究過(guò)程中得出的結(jié)論是，保護(hù)兔免受最初感染既依賴(lài)于Th1細(xì)胞應(yīng)答(T細(xì)胞浸潤(rùn)及產(chǎn)生γ干擾素)，也需要調(diào)理素抗體的作用。國(guó)外研究常以Ribi佐劑(含單磷脂酰A、合成海藻糖和細(xì)胞壁骨架)誘導(dǎo)Th1細(xì)胞應(yīng)答和功能性抗體產(chǎn)生，以重組蛋白加Ribi佐劑可誘導(dǎo)較明顯的保護(hù)作用[19-20]。但商品化的Ribi佐劑已不再生產(chǎn)，曾嘗試過(guò)其它佐劑但降低了保護(hù)作用，因而需要發(fā)展和應(yīng)用其它的佐劑用于梅毒疫苗研究。

4.2人類(lèi)對(duì)Tp感染的免疫應(yīng)答目前對(duì)人類(lèi)的免疫知之甚少。眾所周知，患過(guò)梅毒的人群可反復(fù)感染。研究表明，晚期潛伏梅毒患者將可以抵抗異源Tp株的再次感染不出現(xiàn)癥狀，但那些更早階段的患者可再次感染，這與Miller在動(dòng)物中使用疫苗若要誘導(dǎo)完全保護(hù)需長(zhǎng)期的免疫周期是一致的。在兔體內(nèi)形成的免疫具有Tp亞種甚至株的特異性，這種特異性很可能與Tp株間抗原差異有關(guān)。因此，研發(fā)梅毒疫苗不但需要長(zhǎng)期的免疫過(guò)程，而且在選擇免疫原時(shí)需要注意菌株中抗原多樣性和抗原變異在免疫逃避中的作用。

5 梅毒疫苗研發(fā)必需考慮因素與益處

5.1疫苗的關(guān)鍵需求開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)有效梅毒疫苗至少需要幾個(gè)關(guān)鍵需求：(1)疫苗需要防止初期的硬下疳和二期病變的形成以阻斷梅毒和艾滋病的傳播，抑制Tp在宿主內(nèi)播散，阻止梅毒發(fā)展和形成先天性梅毒。(2)由于在梅毒感染期間調(diào)理吞噬作用對(duì)Tp的清除起關(guān)鍵作用，因此疫苗需要有效激發(fā)Th1型應(yīng)答和調(diào)理素抗體產(chǎn)生。(3)疫苗能廣泛保護(hù)機(jī)體免受各種Tp菌株的感染。采用單一Tp蛋白無(wú)法滿(mǎn)足這些需求，因此有效疫苗需要多個(gè)組分組成。

5.2需要解決的問(wèn)題經(jīng)過(guò)近一個(gè)世紀(jì)的研究，人們?cè)谕酶腥灸Ｐ椭袑?duì)免疫保護(hù)相關(guān)因素有了深入的了解。然而，疫苗的成功研制還需要通過(guò)在基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室和臨床之間的信息交流，以進(jìn)一步了解對(duì)人類(lèi)的相關(guān)保護(hù)。發(fā)展適當(dāng)有效佐劑必不可少并可能需要工業(yè)化生產(chǎn)。在疫苗研究領(lǐng)域中需要大規(guī)模應(yīng)用“組學(xué)”方法和數(shù)據(jù)分析來(lái)全面理解Tp，如在Tp亞型和Tp株間的基因和蛋白表達(dá)差異。當(dāng)前最重要研究任務(wù)是明確Tp的表面抗原，不僅包括OMP，也需要延伸范圍至非蛋白抗原(如膜脂抗原)和經(jīng)糖基化或甲基化翻譯后修飾的表面蛋白。完成這些目標(biāo)需要一大批從事梅毒基礎(chǔ)研究的科學(xué)家投入到該領(lǐng)域進(jìn)行持續(xù)研究，將面臨技術(shù)障礙和和高額的研究經(jīng)費(fèi)問(wèn)題。此外，為促進(jìn)梅毒疫苗的發(fā)展，需要對(duì)發(fā)達(dá)國(guó)家市場(chǎng)做出準(zhǔn)確評(píng)估，應(yīng)考慮應(yīng)用梅毒疫苗可降低艾滋病發(fā)生率以及疫苗發(fā)展帶來(lái)的行業(yè)利益。

5.3梅毒疫苗研發(fā)的益處多種原因有利于研發(fā)梅毒疫苗：(1)Tp僅寄生于人體，在全球成功接種可有效消除這種疾病。(2)兔動(dòng)物模型展示了人類(lèi)感染初期、二期和三期各階段的特征，可采用適當(dāng)?shù)暮蜻x疫苗進(jìn)入臨床前研究以準(zhǔn)確評(píng)估其保護(hù)性能。(3)Tp對(duì)青霉素高度敏感，即使在疫苗保護(hù)試驗(yàn)失敗后仍可用青霉素完全治愈，這將極大吸引志愿者參與臨床試驗(yàn)及廠(chǎng)商贊助。(4)射線(xiàn)致弱Tp可誘導(dǎo)完全保護(hù)為發(fā)展梅毒疫苗提供了可行性。雖然由脂質(zhì)和外膜蛋白的Tp外膜給疫苗研究造成了困難，但Tp相對(duì)簡(jiǎn)單的表面又有利于梅毒疫苗的研發(fā)。事實(shí)上，如果梅毒疫苗成分被發(fā)現(xiàn)，將減少疫苗研發(fā)的費(fèi)用，使生產(chǎn)過(guò)程流水化，提高生產(chǎn)梅毒疫苗的行業(yè)利益。

疫苗接種被認(rèn)為是世界上最重要和節(jié)省成本的公共衛(wèi)生舉措，因?yàn)槠錇樯鐣?huì)帶來(lái)積極的健康效應(yīng)和經(jīng)濟(jì)效益。由于梅毒給全球造成持續(xù)性負(fù)擔(dān)，增加傳播艾滋病的風(fēng)險(xiǎn)，感染性梅毒和先天性梅毒顯著的發(fā)病率及死亡率，從概念上、戰(zhàn)略上和財(cái)政支持上都迫切需要研發(fā)疫苗預(yù)防梅毒這一嚴(yán)重疾病。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.03.026

2015-01-07；

2015-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273322)；湖南省衛(wèi)生廳課題(B2013—035).

*通訊作者，E-mail：nhdxztb@126.com.

R377.1

A

(此文編輯：蔣湘蓮)