海藻酸鈉濃度對新型神經(jīng)組織工程支架結(jié)構(gòu)與性能的影響

張 琨， 馬珊珊， 孟 楠， 邢 衢， 石振慶， 關(guān)方霞

(1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001；2.鄭州大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 河南 鄭州 450052)

海藻酸鈉濃度對新型神經(jīng)組織工程支架結(jié)構(gòu)與性能的影響

張 琨1,2， 馬珊珊1， 孟 楠1， 邢 衢1， 石振慶1， 關(guān)方霞1,2

(1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001；2.鄭州大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 河南 鄭州 450052)

探討海藻酸鈉溶液的濃度變化對藻酸鹽水凝膠新型組織工程支架結(jié)構(gòu)與性能的影響.在氯化鈣溶液濃度相同的條件下，改變海藻酸鈉溶液的濃度，制備出不同原料配比的藻酸鹽水凝膠，冷凍干燥后于光學(xué)顯微鏡下觀察其微觀結(jié)構(gòu)變化，測定水凝膠的含水率與凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)；將無菌的海藻酸鈉溶液及間充質(zhì)干細(xì)胞混合后，與氯化鈣溶液反應(yīng)得到包載干細(xì)胞的藻酸鹽水凝膠，倒置熒光顯微鏡下觀察水凝膠所釋放出細(xì)胞的存活情況.在氯化鈣濃度一定的條件下，隨著海藻酸鈉濃度的減小，水凝膠的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)由致密變得疏松，更易于細(xì)胞的生存與釋放.實驗表明，海藻酸鈉水凝膠作為組織工程支架，用于神經(jīng)損傷后修復(fù)具有較好的應(yīng)用前景.

海藻酸鈉； 氯化鈣； 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞； 神經(jīng)組織工程支架

0 引言

脊髓損傷(spinal cord injury)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，具有高發(fā)性、高致殘性、高耗費(fèi)性和低齡化的特點，為世界性臨床醫(yī)學(xué)難題[1].外源性干細(xì)胞治療脊髓損傷頗具前景，然而，對于所移植干細(xì)胞的存活與分化還缺乏有效的控制[2].如何構(gòu)建神經(jīng)組織工程支架、獲得適宜的干細(xì)胞微環(huán)境是再生醫(yī)學(xué)面臨的一大挑戰(zhàn).水凝膠作為一種具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、含水量較大的聚合物/液體二元體系，其良好的機(jī)械性能、生物相容性和生物降解性，可以模仿天然的細(xì)胞外基質(zhì)，用于功能分子或細(xì)胞的載體促進(jìn)組織修復(fù)[3].海藻酸鈉是從褐藻中提取的水溶性聚醛酸，具有良好的生物相容性，有利于神經(jīng)軸突的生長和細(xì)胞的遷移.海藻酸鈉水凝膠包載細(xì)胞的研究始于1980年，包載Schwann細(xì)胞能夠促進(jìn)損傷處的功能恢復(fù)與神經(jīng)再生[4].Keren等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)改性的海藻酸鈉水凝膠有利于干細(xì)胞的分化[5].海藻酸鈉水凝膠聯(lián)合膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，有助于促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[6].然而，適宜的結(jié)構(gòu)(如孔徑尺寸)是促進(jìn)組織再生的關(guān)鍵[7]，因此，本研究通過海藻酸鈉的濃度變化，探討海藻酸鈉水凝膠的交聯(lián)程度對其結(jié)構(gòu)與生物學(xué)性能的影響，為獲得適宜的組織工程支架進(jìn)行神經(jīng)修復(fù)與重建提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 水凝膠的制備與微觀結(jié)構(gòu)的表征

固定氯化鈣溶液為25 mmol/L，采用去離子水，分別配置濃度為0.125%，0.25%，0.5%，1%，2%的海藻酸鈉溶液.將海藻酸鈉和CaCl2以一定的比例混合，凝膠化反應(yīng)后制成水凝膠.將凝膠放入-20 ℃冰箱12 h后移入-80 ℃冰箱，放置12 h后使用冷凍干燥機(jī)充分干燥，在光學(xué)顯微鏡下觀察不同水凝膠改造后的微觀結(jié)構(gòu).

1.3 水凝膠含水率、凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

取不同濃度的海藻酸鈉溶液0.5 mL到EP管中，再分別加25 mmol/L的氯化鈣0.5 mL進(jìn)行反應(yīng).待凝膠化完全后，取出上清液并測出體積，計算得到凝膠的體積.稱量得出凝膠的濕重.將凝膠冷凍干燥后，稱重，得出凝膠干重.分別代入含水率、凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算公式求出含水率與凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù).

設(shè)定凝膠體積v，凝膠的濕重m′，凝膠的干重m″，含水率s，凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)p.則含水率與凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計算公式分別為： s=((m′-m″)/m′)×100% ， p=(m″/v)×100% .

1.4 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞從水凝膠中的釋放與存活

取培養(yǎng)至第3代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，在DMEM/F12培養(yǎng)基中加入10%的FBS配置完全細(xì)胞培養(yǎng)基，用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng).選用DMEM/F12培養(yǎng)基配置濃度為0.125%，0.25%，0.5%，1%，2%的海藻酸鈉溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌后分別與細(xì)胞懸液混合，再與無菌氯化鈣溶液反應(yīng)生成包載間充質(zhì)干細(xì)胞的水凝膠.待凝膠形成后棄去上清液，加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液，于5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育12小時后換取新的培養(yǎng)液，1天后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，采用倒置熒光顯微鏡觀察水凝膠中細(xì)胞的釋放與存活.

2 結(jié)果

2.1 海藻酸鈉濃度對水凝膠機(jī)械性能的影響

上式中Y為被解釋變量，X為解釋變量，i為樣本個數(shù)，隨機(jī)擾動項μ代表著那些對Y有影響但又未納入模型的諸多因素的綜合影響。為了使對模型的估計具有良好的統(tǒng)計性質(zhì)，對無法直接觀測的隨機(jī)擾動項的分布，需要進(jìn)行以下一些基本假定：

2.1.1 水凝膠微觀結(jié)構(gòu)隨海藻酸鈉濃度的變化 將不同海藻酸鈉濃度下制備的水凝膠進(jìn)行冷凍干燥后，通過光學(xué)顯微鏡對其形態(tài)進(jìn)行觀察，所得結(jié)果如圖1所示.結(jié)果顯示，海藻酸鈉水凝膠具有“蛋盒”狀結(jié)構(gòu)[4]，隨著海藻酸鈉濃度的增加，形成的水凝膠更加規(guī)則且結(jié)構(gòu)致密，相反，海藻酸鈉濃度低的凝膠結(jié)構(gòu)規(guī)則性變小且薄而稀疏.

2.1.2 水凝膠含水率和凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨海藻酸鈉濃度的變化 通過對不同水凝膠進(jìn)行含水率及凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定與計算，得到5組的含水率與凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如表1所示.從表中每組實驗數(shù)據(jù)的結(jié)果來分析，海藻酸鈉水凝膠的含水率和凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)均受海藻酸鈉的濃度影響.當(dāng)鈣離子濃度不變的情況下，海藻酸鈉的濃度越大時，形成的凝膠的含水率越低，而凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大.這進(jìn)一步說明，在一定的鈣離子濃度下，海藻酸鈉的濃度越大，形成的凝膠越致密.

2.2 海藻酸鈉濃度對水凝膠細(xì)胞相容性的影響

在氯化鈣濃度固定為25 mmol/L條件下，選用海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.125%，0.25%，0.5%，1%，2%，制備包載臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的水凝膠，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1天后的結(jié)果如圖2所示.由熒光顯微鏡下的圖片可以發(fā)現(xiàn)，在海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.125%，0.25%，0.5%時，水凝膠釋放出大量的貼壁細(xì)胞，而0.125%海藻酸鈉溶液獲得的水凝膠所在孔板處的貼壁細(xì)胞數(shù)量最多；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大到1%、2%時，貼壁細(xì)胞的數(shù)量明顯逐漸減少.結(jié)果表明，在氯化鈣濃度不變的條件下，海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化會影響水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響所包載臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的活性.

3 討論

海藻酸鈉具有良好的生物相容性和生物降解性，在溫和的條件下，易與二價陽離子發(fā)生離子交換從而經(jīng)由外部凝膠化途徑形成水凝膠[8].實驗中采用的是最常用的控制變量法，保證其他一切變量相同，只改變海藻酸鈉的濃度進(jìn)行反應(yīng).在制備水凝膠過程中，測出凝膠的體積、濕重，并將凝膠冷凍干燥后稱得干重，得到了凝膠的含水率和凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)凝膠的含水率隨著海藻酸鈉濃度的減小而增大，凝膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著海藻酸鈉的濃度減小而減小.這是由于實驗中所選用的鈣離子濃度一定的條件下，隨著海藻酸鈉溶液的加入，鈣離子逐漸將鈉離子置換出來，并交聯(lián)形成三維空間網(wǎng)絡(luò).同時，在海藻酸鈉與氯化鈣溶液等體積加入的情況下，隨著海藻酸鈉濃度的增大，參與反應(yīng)的鈣離子增多，因此所形成的凝膠結(jié)構(gòu)會越發(fā)致密[9]，該結(jié)果從微觀結(jié)構(gòu)的圖片可以得到印證.因此，越多的海藻酸鈉分子經(jīng)離子交聯(lián)形成水凝膠，則凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)就會越大；由于海藻酸鈉溶液的體積一定，因此，隨著海藻酸鈉濃度的增大，凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，而含水率減小.

實驗中選用不同海藻酸鈉濃度制備包載臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的水凝膠，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1天后發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉濃度的變化會影響水凝膠包載臍帶干細(xì)胞的活性.其中隨著海藻酸鈉濃度的降低，水凝膠所釋放出的細(xì)胞在孔板處的貼壁數(shù)量逐漸增多，以0.125%時的貼壁細(xì)胞數(shù)量最多.這是由于在細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，隨著培養(yǎng)時間的延長，離子交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中的鈣離子擴(kuò)散到周圍培養(yǎng)基中，使得水凝膠交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生降解[10]，細(xì)胞得以釋放，而氯化鈣溶液的濃度比重越低，水凝膠網(wǎng)絡(luò)的降解會更快，細(xì)胞則更容易釋放出來.

[1] Brian J C，Nobuko U，Stanley J T，et al．Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice[J]．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102(39)：14069-14074.

[2] Andrea J M，Roger Y T，Tasneem Z，et al．Repair of the injured spinal cord by transplantation of neural stem cells in a hyaluronan-based hydrogel[J]．Biomaterials，2013，34(15)：3775-3783．

[3] Sudhakar C K，Nitish U，Ankush J，et al．Nanotechnology Applications for Tissue Engineering[M]．Atlanta:Elsevier,2015，77-94．

[4] 王海寶，馬學(xué)強(qiáng)．雪旺細(xì)胞-海藻酸鈣凝膠移植對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)絲蛋白表達(dá)的影響[J]．中醫(yī)正骨，2008，20(6)：1-3．

[5] Keren Z, Harald N, Yael B H, et al．A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation[J]．Biomaterials, 2014, 35(12)：3736-3743．

[6] Eduardo A，Pauline D B，Bernard U，et al．Injectable alginate hydrogel loaded with GDNF promotes functional recovery in a hemisection model of spinal cord injury[J]．International Journal of Pharmaceutics，2013，455(1/2)：148-158．

[7] Jinah J，Young J S，Hyeon J K，et al．Effects of alginate hydrogel cross-linking density on mechanical and biological behaviors for tissue engineering[J]．Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials，2014，37：69-77．

[8] 余晨晨．明膠/海藻酸鹽復(fù)合凝膠微球支架的構(gòu)建與表征[D]．廣州：華南理工大學(xué)，2014．

[9] Cristiana B da C，Darinka D K，Li W W A，et al．Influence of the stiffness of three-dimensionalalginate/collagen-I interpenetrating networks on fibroblast biology[J]．Biomaterials，2014，35(32)：8927-8936．

[10]Shoichet M S，Li R H，White M L，et al．Stability of hydrogelsused in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate andagarose[J]．Biotechnology and Bioengineering，1996，50：374-381．

(責(zé)任編輯：王浩毅)

Effect of Sodium Alginate Concentration on the Structure and Properties of a New Scaffold for Nerve Tissue Engineering

ZHANG Kun1,2，MA Shanshan1，MENG Nan1，XING Qu1，SHI Zhenqing1，GUAN Fangxia1,2

(1.SchoolofLifeScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.FirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

To investigate the influence of the different sodium alginate concentration on the structure and property of hydrogel as scaffold for tissue engineering. With the same concentration of calcium chloride solution, different concentration of sodium alginate solution was mixed to prepare different types of hydrogels. The water content of hydrogel and gel mass fraction were determined, and their freeze dried microstructure changes were observed under the optical microscope.To obtain the hydrogel loading mesenchymal stem cells,the sterile sodium alginate solution and stem cells were mixed and reacted with calcium chloride solution. Then the survival cells released from the different hydrogels were observed using an inverted fluorescence microscopeation. Under the condition of certain concentration of calcium chloride, the network structure of hydrogel was becoming looser and easier for stem cells to survive and release, with the decrease of the concentration of sodium alginate. It could be concluded that sodium alginate hydrogel as tissue engineering scaffold had a good prospect for nerve injury repair application.

sodium alginate； calcium chloride； umbilical cord mesenchymal stem cells； nerve tissue engineering scaffold

2015-09-17

河南省博士后科研項目，編號2014020.

張琨(1985—)，女，河南睢縣人，講師，博士，主要從事生物醫(yī)學(xué)工程研究，E-mail:zhangkun@zzu.edu.cn；通訊作者：關(guān)方霞(1969—)，女，河南澠池人，教授，博士，主要從事干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究，E-mail:guanfangxia@126.com.

張琨，馬珊珊，孟楠，等．海藻酸鈉濃度對新型神經(jīng)組織工程支架結(jié)構(gòu)與性能的影響[J]．鄭州大學(xué)學(xué)報：理學(xué)版，2015，47(4)：99-102．

Q813.1，Q189

A

1671-6841(2015)04-0099-04

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.04.019