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    GST-NAP融合蛋白可溶性表達及柱上切割GST標簽

    2015-01-21 18:25:22黃夏冰康巧珍汲振余
    鄭州大學學報(理學版) 2015年4期
    關鍵詞:層析柱谷胱甘肽可溶性

    黃夏冰, 康巧珍, 傅 國, 汲振余, 劉 鑫

    (1.鄭州大學 生命科學學院 分子免疫學實驗室 河南 鄭州 450000;2.河南省醫(yī)藥科學研究院 河南 鄭州 45000)

    GST-NAP融合蛋白可溶性表達及柱上切割GST標簽

    黃夏冰1, 康巧珍1, 傅 國1, 汲振余2, 劉 鑫1

    (1.鄭州大學 生命科學學院 分子免疫學實驗室 河南 鄭州 450000;2.河南省醫(yī)藥科學研究院 河南 鄭州 45000)

    利用基因工程的方法,以實驗室保存的pMAL-C2X-NAP質粒為模板,PCR擴增NAP基因, 構建重組質粒pGEX-NAP.重組質粒通過酶切和測序鑒定后轉化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3),再經IPTG低溫誘導獲得可溶性GST-NAP融合蛋白,最后利用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠樹脂進行純化,Prescission蛋白酶進行柱上切割去除GST標簽.結果表明,pGEX-NAP重組質粒構建正確,在大腸桿菌中經IPTG低溫誘導表達,可獲得大量可溶性GST-NAP融合蛋白.Prescission蛋白酶柱上切割去除GST標簽后,經Western Blot 驗證NAP蛋白能被兔抗NAP多克隆抗體特異識別.

    GST-NAP; 重組質粒; 蛋白表達; GST標簽

    0 引言

    HP-NAP是幽門螺桿菌中的一種能趨化并激活中性粒細胞的可溶性蛋白,它能促進中性粒細胞黏附胃黏膜內皮,并且能夠刺激中性粒細胞產生大量的氧自由基.到目前為止,HP-NAP被證實是Dps(DNA protection during starvation)家族中唯一能夠激活人類白細胞的蛋白,和HP-NAP結構相似的Flp、Dlp-1和Dlp-2都沒有此功能.與其他結構相似的分子比較,HP-NAP具有獨特陽離子電荷簇,這可能有利于炎癥細胞的激活.已有報道,HP-NAP具有通過逆轉Th1/Th2平衡,抗旋毛蟲感染,抗哮喘及治療腫瘤的潛力[1-8],同時也被認為是極具潛力的侯選免疫調節(jié)劑[9].

    HP-NAP可從幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)水抽提物中獲得,然而由于H.pylori培養(yǎng)條件較為苛刻,無法進行H.pylori的大規(guī)模培養(yǎng),且體外條件下不同菌株HP-NAP表達量差異較大,因此,大量HP-NAP的穩(wěn)定獲得受到較大限制[10].目前,利用基因工程的方法重組表達目的基因,能夠快速簡便得到大量蛋白[11].E.coli作為基因工程菌, 具有生產周期短、成本低、易線性放大等優(yōu)點,且該工程菌質粒上攜帶有多種融合標簽,有利于目標蛋白的表達純化[12].作為E.coli原核表達系統(tǒng)融合標簽,谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)能夠增加外源蛋白的可溶性[13-16].pGEX系列載體是高效表達GST的原核表達載體,其中pGEX-6P-1帶有IPTG誘導啟動子, 融合蛋白產物帶有GST標簽,因此可通過GST層析柱簡便、快速地純化,最終可以通過Prescission蛋白酶切割GST標簽快速釋放目的蛋白.

    本研究構建了HP-NAP的原核表達質粒pGEX-NAP, 通過誘導表達、純化得到大量的GST-NAP,經柱上切割成功去除GST標簽,得到的NAP蛋白經Western Blot驗證可被兔抗NAP多克隆抗體特異識別.本研究為進一步研究HP-NAP的功能奠定基礎.

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 質粒與菌株 pMAL-C2X-NAP質粒及pGEX-6P-1質粒均為本實驗室保存;E.coliDH5α、BL21(DE3)感受態(tài)購自于鄭州鼎國生物有限公司.

    1.1.2 試劑 Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶EcoRⅠ、SalⅠ、質粒DNA小量提取試劑盒、DNA marker購自于寶生物工程(大連)有限公司;還原型谷胱甘肽、谷胱甘肽瓊脂糖樹脂購自于上海生工生物工程公司;低相對分子質量蛋白marker購自于北京全式金有限公司;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺等購自于鄭州鼎國生物有限公司.

    1.2 方法

    1.2.1 pGEX-NAP重組質粒的構建 首先,以本實驗室構建并保存的pMAL-C2X-NAP質粒為模板擴增出HP-NAP基因,擴增HP-NAP基因的所用引物為:

    F: 5′-GGAGAATTCATGAAAACATTTGAAATTTTA-3′(含有EcoRⅠ酶切位點),

    R: 5′-AAGTCGACTTAAGCTAAATGGGCTTGCAGC-3′(含有SalⅠ酶切位點).

    然后將擴增得到的HP-NAP片段和空質粒載體pGEX-6P-1用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切,酶切產物膠回收后用T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接.最后將連接產物轉化到DH5a感受態(tài)細胞中,取少量菌液涂布到含氨芐的LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)16 h后挑取單菌落,接種于含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜,次日提取質粒.經EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切電泳驗證,結果正確的質粒送去測序.

    1.2.2 GST-NAP融合蛋白的誘導表達 將重組質粒pGEX-NAP轉化到BL21感受態(tài)細胞中,37 ℃倒置培養(yǎng)過夜.次日挑取單菌落,接種于5 mL LB培養(yǎng)基中(含Amp 100 μg/mL),37 ℃,200 rpm活化過夜.然后按1%比例接種于500 mL LB培養(yǎng)基中(含Amp 100 μg/mL),37 ℃,230 rpm擴大培養(yǎng)3 h.最后加入誘導劑IPTG至終濃度0.5 mmol/L,15 ℃過夜培養(yǎng).取200 μL菌液,離心棄上清,SDS-PAGE電泳分析.

    1.2.3 GST-NAP融合蛋白的純化 將誘導表達后的菌液用50 mL離心管分裝,4 000 rpm離心5 min,棄上清.用5 mL GST binding buffer(含有1% Triton X-100的PBS)重懸沉淀,-20 ℃凍存過夜.室溫解凍后用40 mL GST binding buffer重懸,冰浴條件下使用300 W短脈沖超聲處理(超聲處理10 s,間隔15 s)重復20~30次至菌液透明.將超聲破碎后的菌體于4 ℃、9 000 rpm離心20 min,取上清置于另一無菌的50 mL離心管中,沉淀用5 mL GST binding buffer重懸,分別對超聲上清和沉淀物進行可溶性及超聲破碎效果分析.取1 mL谷胱甘肽瓊脂糖樹脂加入到3 mL層析柱中,制備簡易重力親和層析柱.使用10 mL GST binding buffer平衡層析柱,加入菌體上清25 mL,經10 mL GST binding buffer洗滌后,使用12 mL Elution buffer(10 mmol/L還原型谷胱甘肽,50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)洗脫得到GST-NAP,并用PBS進行透析.純化后的蛋白通過SDS-PAGE驗證.

    1.2.4 Prescission protease柱上切割GST-NAP融合蛋白 在1 mL層析柱中加入400 μL GST樹脂,將純化透析后的GST-NAP按照純化步驟進行平衡、上樣、洗滌.配制酶切反應體系(PP酶10 μL,10×cleavage buffer 50 μL,ddH2O 440 μL)加入到層析柱中,4 ℃反應16 h后,分多管收集流出液,并用Elution buffer洗脫蛋白.流出液及洗脫蛋白通過SDS-PAGE驗證.

    1.2.5 Western Blot鑒定NAP蛋白 將流出液經SDS-PAGE分離后,在110 V、65 min條件下轉至硝酸纖維膜(NC)上,用1%BSA室溫封閉1.5 h;使用TBST(含0.9% NaCl的10 mmol/L Tris溶液加入適量Tween-20,PH 7.4)以1∶8 000稀釋的兔抗NAP抗體常溫孵育2 h后,TBST洗膜3次,每次10 min;再用TBST以1∶8 000稀釋的羊抗兔IgG常溫孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min;最后進行增強化學發(fā)光(ECL)顯色反應曝光.

    2 結果

    2.1 HP-NAP基因的擴增

    以pMAL-C2X-NAP質粒為模板,使用帶有酶切位點的引物進行PCR擴增,得到了含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點的435 bp片段,與目標條帶大小一致(圖1).

    2.2 重組質粒pGEX-NAP的酶切鑒定

    利用EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點將HP-NAP片段克隆到pGEX-6P-1質粒中,轉化到DH5α感受態(tài)細胞,挑取陽性克隆菌落,搖菌提取質粒,用SalⅠ和EcoRI雙酶切進行鑒定,如圖2所示結果.經雙酶切后得到兩條條帶,分別為5 000 bp(載體pGEX-6P-1)和435 bp(目的基因NAP).將重組質粒測序并在Genbank數(shù)據(jù)庫中使用同源性分析軟件BLAST比對測序結果,目的片段序列與數(shù)據(jù)庫中的HP-NAP基因序列完全一致.

    2.3 GST/NAP融合蛋白的表達、鑒定及可溶性分析

    構建好的重組質粒pGEX-NAP轉化BL21,挑取單菌落,擴培后提取質粒,用NAP特異性引物進行PCR鑒定.對于鑒定正確的菌株,用IPTG對菌株進行15 ℃低溫誘導表達,收集菌體進行超聲破碎,SDS-PAGE結果顯示在43 kD處可見明顯的蛋白條帶,其與目標蛋白GST-NAP融合蛋白大小一致(圖3).同時,菌體經超聲破碎后離心,對其沉淀物和上清進行SDS-PAGE,在43 kD處均出現(xiàn)條帶,且在同等上樣條件下,上清中的目標蛋白條帶更為明顯.結果顯示,在15 ℃誘導條件下,GST-NAP融合蛋白主要以可溶的形式存在,如圖4所示.

    2.4 GST-NAP融合蛋白純化

    取1 mL谷胱甘肽瓊脂糖樹脂加入到3 mL層析柱中,制備簡易重力親和層析柱.使用10 mL GST binding buffer平衡層析柱,加入2.3中制備的菌體上清25 mL,經10 mL GST binding buffer洗滌后,使用12 mL洗脫液洗脫.對洗脫液進行SDS-PAGE鑒定,顯示在43 kD處有唯一一條蛋白條帶(圖5).結果表明,經親和層析得到了純化的GST-NAP融合蛋白.

    2.5 Prescission protease柱上切割GST-NAP融合蛋白

    在1 mL層析柱中加入400 μL樹脂,按照純化步驟進行平衡、上樣(純化透析后的GST-NAP)、洗滌,然后加入PP酶切反應體系,4 ℃反應16 h后,分多管收集流出液,使用Elution buffer洗脫蛋白.流出液及洗脫蛋白經SDS-PAGE驗證,17 kD的NAP單體存在于流出液中,洗脫蛋白為26 kD的GST標簽(圖6).

    2.6 Western Blot 鑒定NAP蛋白

    將流出液經SDS-PAGE分離后,進行轉膜、封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、ECL曝光處理得到Western Blot結果.兔抗NAP抗體與流出液中的NAP蛋白特異性結合,表明PP酶柱上切割成功獲得NAP蛋白(圖7).

    3 討論

    由于目前大量獲取HP-NAP較為困難,不利于研究應用.因而,本研究嘗試用簡便、高效的大腸桿菌表達載體pGEX-6P-1構建重組載體pGEX-NAP,通過誘導表達、純化得到大量的GST-NAP,經Prescission蛋白酶柱上切割GST標簽后,成功得到HP-NAP.

    在誘導蛋白表達過程中,當使用37 ℃誘導表達時,在0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.3 mmol/L,0.4 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG濃度下, GST-NAP融合蛋白均為不可溶的包涵體蛋白.為了避免后續(xù)的變復性工作,嘗試了低溫誘導,當誘導溫度降至15 ℃時誘導產物絕大部分為可溶的形式,并且在0.5 mmol/L IPTG條件下可溶性蛋白表達量最高.隨后對純化后的GST-NAP用Prescission蛋白酶進行柱上切割去除GST標簽.Prescission蛋白酶能夠識別pGEX-6P-1載體表達的蛋白序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro,并且特異性地在Glu和Gly殘基之間進行切割[17].Prescission蛋白酶在4 ℃具有最大活性,因此選擇在低溫下進行切割.最初嘗試對結合在1 mL樹脂上的GST-NAP進行直接切割,但并未成功,推斷可能是由于酶切體系較小導致柱上切割不理想.隨后嘗試用小體積的樹脂和大于樹脂體積的酶切體系進行切割,最終實現(xiàn)GST-NAP的柱上切割.本研究提供了一種簡便快速獲取HP-NAP的方法,HP-NAP蛋白的表達純化成功將為下一步研究提供重要的實驗材料.

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    (責任編輯:王浩毅)

    Expression of Soluble GST-NAP Fusion Protein and GST-tag-cleavage on Column

    HUANG Xiabing1, KANG Qiaozhen1, FU Guo1, JI Zhenyu2, LIU Xin1

    (1.LaboratoryofMolecularImmunology,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.InstituteofMedcine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

    To obtain plenty of HP-NAP (H.pylorineutrophil-activating protein) for research, NAP gene was amplified from pMAL-C2X-NAP vector by PCR, and the recombinant plasmid pGEX-NAP was constructed. After verified by enzyme digestion and gene sequencing analysis, pGEX-NAP was transformed intoE.coliBL21(DE3)and the soluble fusion protein GST-NAP was obtained by inducing with IPTG in low temperature. Then GST-NAP was purified with Glutathione Sefinose Resin, and cleavaged GST-tag with Prescission protease on column. In conclusion, recombinant plasmid pGEX-NAP was successfully constructed and soluble GST-NAP fusion protein was efficiently expressed inE.coli. High purity HP-NAP can be obtained by Prescission protease cleavage on column. NAP protein was recognized by Rabbit anti-NAP mAb using Western Blot.

    GST-NAP; recombinant plasmid; protein expression; GST-tag

    2015-07-23

    重大新藥創(chuàng)制科技重大專項基金項目,編號2012ZX09103301- 022;國家自然科學基金資助項目,編號U1204817,81373119.

    黃夏冰(1990—),女,河南漯河人,碩士研究生,主要從事分子免疫研究,E-mail:huangxiabing1990@163.com;通訊作者:劉鑫(1981—),女,甘肅白銀人,講師,博士,主要從事免疫性疾病的發(fā)病機制及治療研究, E-mail:liux@zzu.edu.cn.

    黃夏冰,康巧珍,傅國,等.GST-NAP融合蛋白可溶性表達及柱上切割GST標簽[J].鄭州大學學報:理學版,2015,47(4):94-98.

    Q786

    A

    1671-6841(2015)04-0094-05

    10.3969/j.issn.1671-6841.2015.04.018

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