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    等離子體誘變選育解淀粉芽胞桿菌BI2高產(chǎn)抑菌物質(zhì)

    2015-01-18 12:01:48王亞軍王德培
    飼料工業(yè) 2015年1期
    關(guān)鍵詞:指示菌芽胞肉湯

    ■王亞軍 王 露 王德培,2

    (1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

    常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Tem?perature Plasma,ARTP)是近幾年發(fā)展起來的一種等離子體源,能夠在常溫、常壓下產(chǎn)生高活性粒子濃度的等離子體射流。其中的活性粒子作用,使微生物細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變,并引起基因損傷,進(jìn)而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)顯著改變,最終導(dǎo)致微生物產(chǎn)生突變。研究表明,ARTP對細(xì)菌、真菌等多種微生物具有良好的誘變效果。與傳統(tǒng)誘變方法相比,采用ARTP誘變處理能夠有效造成DNA多種損傷,突變率高,并易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株。Wang等系統(tǒng)研究了ARTP對于DNA、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞的作用效果及其機(jī)理,將其應(yīng)用于阿維鏈霉菌的誘變,成功獲得了阿維菌素產(chǎn)量提高菌株,證明了ARTP用于微生物誘變育種的有效性。近年,利用ARTP誘變選育高產(chǎn)菌株的報(bào)道也越來越多,鄭明英等利用ARTP系統(tǒng)誘變嗜醋酸棒桿菌篩選出一株產(chǎn)脯氨酸突變株,使脯氨酸產(chǎn)量提高20.3%。薛剛等采用ARTP誘變1株產(chǎn)高溫蛋白酶的地衣芽胞桿菌,選育出1株高產(chǎn)突變株Bacillus licheniformis TP1-5,產(chǎn)酶活力達(dá)到了33 200 U/ml,為出發(fā)菌株的1.56倍。

    解淀粉芽胞桿菌在其自身的生長過程中可以產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物,部分是一些抗生素,主要包括氨基酸類、肽類、脂肽類、磷脂類、多烯類、核酸類物質(zhì),對多種動(dòng)、植物病原菌有很好的抑制作用,并且可作為根系細(xì)菌促進(jìn)植物生長。因此,近些年,人們在芽胞桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化方面做了大量探索,并希望通過提高發(fā)酵水平,獲得大量芽胞桿菌菌體或代謝產(chǎn)物進(jìn)行生物防治和用于食品防腐領(lǐng)域,以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。本研究利用ARTP誘變系統(tǒng)對解淀粉芽胞桿菌BI2進(jìn)行誘變,以期獲得其高產(chǎn)抑菌性次級(jí)代謝產(chǎn)物的突變菌株,為菌株進(jìn)一步應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 菌種和培養(yǎng)基

    解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BI2由本實(shí)驗(yàn)室自青貯秸稈中分離得到,中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏,保藏號(hào):CGMCC No.3413;黃曲霉(Aspergillus flavus),黑曲霉(Aspergillus niger)均由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院生化工程研究室保存。

    營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(g/l):牛肉膏5.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0,pH值7.2~7.4;固體培養(yǎng)基加20.0 g瓊脂,1×105Pa滅菌20 min。

    PDA培養(yǎng)基:稱取馬鈴薯200 g,切成小塊,加1 000 ml蒸餾水煮沸30 min,雙層紗布過濾,濾液加水至1 000 ml,加入20 g葡萄糖,pH自然,1×105Pa滅菌20 min。

    發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l):牛肉膏 5.0、可溶性淀粉 5.0、玉米漿12.0、NaNO312.0、NaCl 5.0、吐溫80 0.6、谷氨酸鈉20.0,pH值7.5,1×105Pa滅菌20 min。

    1.2 ARTP系統(tǒng)誘變方法

    取在肉湯培養(yǎng)基中經(jīng)7 h培養(yǎng)的解淀粉芽胞桿菌BI2菌液,離心,沉淀用無菌生理鹽水洗滌,稀釋5倍后測600 nm處OD值(0.6~0.8),取10 μl稀釋后的菌液加到特制金屬片上,利用思清源生物科技生產(chǎn)的常壓室溫等離子體育種機(jī)(ARTP)進(jìn)行菌株誘變。本研究采用氦氣作為工作氣體,ARTP操作條件如下:輸入功率:120 W,照射間距:2 mm,氣流量:10 L/min,處理時(shí)間:10、20、25、30、35、40、50、70、90 s。對照未誘變原始菌株。使用微量活菌計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)誘變時(shí)間對BI2致死率的影響。

    1.3 分析方法

    1.3.1 BI2培養(yǎng)和處理方法

    從BI2斜面上挑取菌苔接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h,按2%的接種量接入新鮮肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h,再以2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)36 h后,經(jīng)10 000 r/min離心20 min,取上清作為抑菌物質(zhì)發(fā)酵液。

    1.3.2 初篩

    利用菌株拮抗產(chǎn)生抑菌圈的方法,指示菌有黑曲霉和黃曲霉可供選擇。將霉菌接種在PDA斜面上,35℃培養(yǎng)5 d,取一環(huán)孢子到1 ml生理鹽水中,震蕩搖勻并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),用無菌漏斗濾去菌絲殘?bào)w,稀釋到孢子濃度為5×105cfu/ml,取100 μl孢子懸液涂布至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基平皿上,同時(shí)將ARTP處理后的金屬片置于1 ml生理鹽水中,震蕩后將菌體洗下制成芽胞桿菌懸液,梯度稀釋,各稀釋度取100 μl涂布到上述已預(yù)涂孢子懸液的肉湯培養(yǎng)基平皿上,與兩種霉菌共培養(yǎng),35℃培養(yǎng)36 h后觀察并記錄比較抑菌圈和菌落直徑比值大小。

    1.3.3 復(fù)篩

    通過對比黃曲霉孢子萌發(fā)數(shù)計(jì)算抑菌率的方法。如1.3.2方法制備黃曲霉孢子懸液,孢子濃度為5×104cfu/ml。取BI2除菌發(fā)酵液與滅過菌未凝PDA培養(yǎng)基按1∶6比例混合,搖勻倒入平皿中,培養(yǎng)基凝固后分別涂布100 μl上述黃曲霉孢子懸液,用空白PDA培養(yǎng)基做對照,30℃培養(yǎng)36 h后進(jìn)行孢子萌發(fā)計(jì)數(shù),計(jì)算抑制率,每組做3個(gè)平行。

    抑菌率計(jì)算方法:孢子萌發(fā)抑制率(%)=100×(對照組孢子萌發(fā)數(shù)-實(shí)驗(yàn)組孢子萌發(fā)數(shù))/對照組孢子萌發(fā)數(shù)。

    1.3.4 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    將經(jīng)過篩選得到的正突變程度較大的菌株在營養(yǎng)肉湯斜面培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)10代,后將各代菌株接種于肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液抑菌活性。

    2 結(jié)果

    2.1 誘變時(shí)間對芽胞桿菌BI2致死率的影響

    將培養(yǎng)至對數(shù)生長期中期的BI2菌株經(jīng)離心洗滌后在不同時(shí)間下進(jìn)行ARTP誘變,圖1表明,ARTP處理對BI2的致死作用較強(qiáng),25 s后致死率達(dá)到90%以上;處理90 s以上致死率達(dá)到100%。由現(xiàn)代育種理論可知,當(dāng)微生物菌種的致死率在90%~95%范圍時(shí)正突變率最高,因此從處理時(shí)間為25、30、35、40 s的菌株中進(jìn)行初步篩選。

    2.2 初篩

    誘變處理后的芽胞桿菌BI2,分別涂布于表層涂有兩種霉菌孢子的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上,35℃培養(yǎng)36 h。其中黑曲霉做指示菌時(shí)(見圖2A)形成的抑菌圈較大可準(zhǔn)確測量,黃曲霉做指示菌時(shí)(見圖2B)形成的抑菌圈較小,不易觀察比較和準(zhǔn)確測量,因此選擇黑曲霉作為指示菌篩選抑菌能力強(qiáng)的芽胞桿菌菌株。

    圖1 芽胞桿菌BI2ARTP處理致死曲線

    圖2 芽胞桿菌初篩形成抑菌圈

    從4個(gè)處理時(shí)間的菌株初篩平皿上共892個(gè)菌落中挑選出產(chǎn)抑菌圈的菌落共621株,再將其分別點(diǎn)種于黑曲霉孢子混合培養(yǎng)皿上共培養(yǎng)36 h,再篩選一次,挑選出抑菌圈與菌落直徑比值較大的菌共16株,計(jì)算4個(gè)不同處理時(shí)間的菌株正突變率。表1可見:菌株正突變率最高時(shí),誘變處理時(shí)間為30 s,根據(jù)圖1,此時(shí)芽胞桿菌BI2致死率為92.1%。

    表1 不同處理時(shí)間芽胞桿菌BI2的正突變率

    第二輪初篩結(jié)果見圖3,由圖3可知:16株菌的抑菌圈直徑與菌落直徑比值均高于出發(fā)菌株,但16株菌之間沒有明顯差異,因此需進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。

    圖3 抑菌圈與菌落直徑比

    2.3 復(fù)篩

    將此16株菌經(jīng)肉湯培養(yǎng)基平板分離純化,挑取單菌落接種到液體肉湯培養(yǎng)基活化培養(yǎng)12 h,轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵,后測定抑菌活性,抑菌效果見圖4,圖4A中培養(yǎng)基內(nèi)沒有抑菌物質(zhì),黃曲霉菌落較大,菌絲蔓延較廣,氣生菌絲生長旺盛。圖4B中培養(yǎng)基內(nèi)按BI2發(fā)酵液:PDA培養(yǎng)基(v/v)=1∶6,因發(fā)酵液中含抑菌物質(zhì),黃曲霉孢子萌發(fā)受到抑制,萌發(fā)的菌落數(shù)減少;同時(shí)菌落生長也受到抑制,因此菌落較小。

    計(jì)算抑菌率結(jié)果見圖5,突變株No.3、No.11、No.12、No.13和No.14具有較高的抑菌活性,與出發(fā)菌種(CK)相比,抑菌率分別提高了26.1%、21.7%、23.5%、26.1%和26.9%。因此,選擇這幾株突變株進(jìn)行下一步遺傳穩(wěn)定性的研究。

    2.4 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中將出發(fā)菌株和突變株在肉湯培養(yǎng)基斜面中連續(xù)培養(yǎng)10代,取第1代,第3代,第6代,第8代和第10代的菌種進(jìn)行發(fā)酵,并與出發(fā)菌株(CK)進(jìn)行比較,結(jié)果見表2,No.12菌多代菌株間的抑菌率均能穩(wěn)定保持在75%以上,且平均比出發(fā)菌株抑菌率高22.7%,任意兩代之間差異均不超過10%,表明菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)性能穩(wěn)定,未出現(xiàn)回復(fù)突變情況,所以選擇No.12菌株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)出發(fā)菌株,命名為BI2-12。

    圖4 復(fù)篩時(shí)發(fā)酵液的抑菌圈

    圖5 復(fù)篩抑菌率

    表2 傳代后菌株的抑菌率(%)

    3 討論

    解淀粉芽胞桿菌BI2是一株廣譜拮抗菌,能抑制20多種真菌和細(xì)菌,尤其對霉菌具有很強(qiáng)的抑制能力,能夠產(chǎn)生兩種抑菌物質(zhì)(其中一種已鑒定出是surfactin,另一種待鑒定),分別對菌絲生長和孢子萌發(fā)有抑制作用。因此,對其進(jìn)行誘變處理后篩選出高產(chǎn)抑菌物質(zhì)的菌株對于充分開發(fā)菌株抑菌能力具有重要意義。

    目前關(guān)于采用ARTP系統(tǒng)誘變芽胞桿菌的報(bào)道不多,蔡聰?shù)壤玫入x子體誘變育種技術(shù)誘變凝結(jié)芽胞桿菌篩選出一株木糖耐受力強(qiáng)、L-乳酸產(chǎn)量高的菌株,其L-乳酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高21.51%,糖酸轉(zhuǎn)化率提高16.00%。Guo等利用等離子體誘變篩選出一株拜氏梭菌,提高了菌株的丙酮,丁醇和乙醇產(chǎn)量,大大縮短了發(fā)酵時(shí)間。另外,關(guān)于芽胞桿菌以霉菌作為指示菌通過抑菌圈篩選的研究也較少,王瑞霞等[利用亞硝基弧(NTG)和微波誘變的方法隨機(jī)篩選出兩株芽胞桿菌突變株,其抑菌圈直徑分別比出發(fā)菌株提高了21.8%和14.8%。但這種方法的工作量很大,而且效果不顯著。盧艷回等利用紫外和亞硝基弧兩次誘變,采用瓊脂擴(kuò)散抑菌圈法篩選出一株高產(chǎn)菌株,其抑菌活性比出發(fā)菌株提高了80%。但這種方法不夠精確,誤差較大。本實(shí)驗(yàn)以解淀粉芽胞桿菌BI2為實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行ARTP誘變,通過實(shí)驗(yàn)比較后確定由黑曲霉做指示菌,通過比較抑菌圈與菌落比值的方法初篩,快速獲得正突變程度高的菌株。復(fù)篩選取黃曲霉作為指示菌計(jì)算孢子萌發(fā)抑菌率的方法進(jìn)行篩選,準(zhǔn)確高效,篩選后經(jīng)過遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),獲得一株能夠穩(wěn)定高產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的芽胞桿菌BI2-12。此株菌發(fā)酵液抑菌率能在出發(fā)菌株的基礎(chǔ)上平均提高22.7%。

    4 結(jié)語

    本研究通過開發(fā)用黑曲霉做指示菌產(chǎn)生抑菌圈的篩選方法,為以后芽胞桿菌的篩選提供了思路,通過誘變選育也為進(jìn)一步開發(fā)其潛力奠定了基礎(chǔ)。

    (參考文獻(xiàn)19篇,刊略,需者可函索)

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