蓮葉體外發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定

■包淋斌

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室營(yíng)養(yǎng)飼料開(kāi)發(fā)工程研究中心，江西南昌 330045)

蓮葉（Lotus Leaf）別名荷葉、鮮荷葉、干荷葉、荷葉炭，廣昌縣自古以來(lái)就被稱(chēng)為“蓮鄉(xiāng)”，白蓮的種植和加工歷史非常悠久，16世紀(jì)初明正德《建昌府志》和19世紀(jì)中期清同治《廣昌縣志》就有記載，廣昌白蓮入選中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品。蓮子又名水芝丹，是我國(guó)水生蔬菜栽培中的特種挺水宿根經(jīng)濟(jì)植物,屬睡蓮科蓮屬(Nympheaceae Nelumbo Adans)。荷葉資源在我國(guó)種植面積廣泛，是一種常見(jiàn)的中藥材料，集中分部在黃河、長(zhǎng)江流域，其中浙江、福建、湖北、湖南、江西為主要產(chǎn)地。荷葉采收時(shí)間分布6月到10月初，夏季和秋季采集，曬涼并干燥荷葉，含水量至10%～20%，置放于通風(fēng)處儲(chǔ)存，防止發(fā)霉和蟲(chóng)蛀。荷葉目前主要研究在食用方面及藥用方面，如降脂保健、抑制自由基、食用和抑制病毒等方面。本試驗(yàn)采用上世紀(jì)70年代末期Menke等提出體外人工胃液培養(yǎng)法，該方法在國(guó)內(nèi)外普遍用于評(píng)定飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，國(guó)外稱(chēng)該方法為HFT技術(shù)。與體內(nèi)法相比，體外培養(yǎng)法簡(jiǎn)單易行，試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量要求少，可重復(fù)性好，可批次操作，適合大量樣品分析，而且與體內(nèi)試驗(yàn)相關(guān)性高。其原理是將飼料樣品置于含有瘤胃液培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生CO2、CH4等氣體，產(chǎn)氣量和飼料在動(dòng)物體內(nèi)消化率之間存在相關(guān)性，因此，可以根據(jù)產(chǎn)氣量來(lái)預(yù)測(cè)飼料的消化率。本試驗(yàn)采用體外發(fā)酵法探討蓮葉在錦江黃牛體外發(fā)酵指標(biāo)情況，旨在為科學(xué)利用粗飼料促進(jìn)瘤胃發(fā)酵和肉牛生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料來(lái)源及制備

蓮葉為自然曬干樣，采購(gòu)自廣昌縣周邊農(nóng)戶(hù)，品種為白花蓮。以“四分法”采取樣品，于65℃烘干12 h，粉碎后過(guò)40目篩用于飼料常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分分析及用于體外發(fā)酵試驗(yàn)。各營(yíng)養(yǎng)成分根據(jù)《飼料分析與飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物、日糧及飼養(yǎng)管理

選用江西農(nóng)大動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)試驗(yàn)基地3頭體重（BW）為(300±20)kg，安裝有永久性瘤胃瘺管的健康錦江黃牛。試驗(yàn)動(dòng)物每天飼喂2次（8：00和18：00），先粗后精，自由飲水，用于采集瘤胃液?；A(chǔ)日糧為玉米-麥麩-苔草型，其精粗比為4∶6，滿(mǎn)足反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需求，精料購(gòu)置江西華大牧業(yè)，苔草采購(gòu)于江西鄱陽(yáng)湖草業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司。瘤胃液供體牛日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 瘤胃液供體牛日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)分對(duì)照組及試驗(yàn)組，試驗(yàn)組添加培養(yǎng)底物0.5 g蓮葉而對(duì)照組不加，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。體外產(chǎn)氣裝置參照盧德勛和程茂基的方法進(jìn)行。該裝置主體為恒溫水浴搖床，其水浴溫度和震蕩頻率可調(diào)。選用150 ml帶橡皮塞的酸奶瓶作為培養(yǎng)瓶，橡皮塞上接有帶三通閥的橡膠管，三通閥一端與帶刻度注射器相連。

1.4 人工培養(yǎng)液的配置

A液：稱(chēng)取K2HPO4382.51 mg，KH2PO4292 mg，(NH4)2SO4480 mg，NaCl 200 mg，MgSO4·7H2O 100 mg和Na2CO34 000 mg。將上述試劑混合后加入蒸餾水定容至1 000 ml。該溶液使用前1 d配制待用。

B液：準(zhǔn)確稱(chēng)取EDTA 500 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 200 mg，MnCl·4H2O 200 mg，ZnSO4·7H2O 10 mg，H3BO330 mg，CoCl2·6H2O 20 mg，CuCl2·6H2O 1 mg，NiCl2·6H2O 2 mg和NaMoO43 mg。將上述試劑混合后加蒸餾水定容至1 000 ml。持續(xù)通入CO218 h后，蓋嚴(yán)瓶口，至于冰箱備用。

C液：稱(chēng)取25 gNa2S·9H2O加入80 ml蒸餾水溶解后定容至100 ml，持續(xù)通入CO220 min后，蓋嚴(yán)瓶口，置于冰箱中備用。

培養(yǎng)液制備：準(zhǔn)確量取790.4 ml A液，8 ml B液，經(jīng)充分混和后持續(xù)通入CO218 h，并于培養(yǎng)前1 h加入1.6 ml C液，充分混合。

1.5 瘤胃液的采集

晨飼前在3頭試驗(yàn)牛瘤胃內(nèi)上下左右不同位點(diǎn)采集瘤胃液，灌入39℃并通有CO2的滅菌廣口瓶中，廣口瓶置于裝有39℃蒸餾水的保溫瓶中。采集完后迅速返回試驗(yàn)室，經(jīng)4層紗布過(guò)濾后持續(xù)通入CO2氣體5 min，然后迅速分裝至裝有培養(yǎng)底物和人工培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每個(gè)培養(yǎng)瓶加20 ml瘤胃液，人工培養(yǎng)液40 ml?；旌暇鶆蚝蟠蜷_(kāi)三通閥和振蕩開(kāi)關(guān)，開(kāi)始培養(yǎng)。

1.6 樣品的采集與分析

培養(yǎng)24 h后，記錄產(chǎn)氣量，立即用pH計(jì)測(cè)定pH值。將培養(yǎng)物用紗布過(guò)濾，濾渣無(wú)損失地轉(zhuǎn)移入100 ml大坩堝中，測(cè)定干物質(zhì)消化率。濾液轉(zhuǎn)移至100 ml離心管中，1 500 r/min離心15 min，以去除原蟲(chóng)和飼料大顆粒，然后分裝至10 ml EP管中。分別用三氯乙酸沉淀法和馮宗慈比色法測(cè)定BCP濃度和NH3-N；VFA的測(cè)定采用GC-1690氣相色譜儀（杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司）FID檢驗(yàn)器，OV-1701型毛細(xì)管（30 m×0.32 mm×0.5 μm），2000色譜數(shù)據(jù)工作站，內(nèi)標(biāo)分析法，內(nèi)標(biāo)物為巴豆酸。采用程序升溫，初溫80℃，初時(shí)3.5 min，升速30℃/min，終溫180℃，終時(shí)10 min；進(jìn)樣室溫度260℃，檢測(cè)器溫度260℃；柱前壓力0.05 MPa，氮?dú)庾鳛檩d氣。樣品進(jìn)樣量1 μl。

1.7 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理采用spss17.0和EXCEL 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮葉各營(yíng)養(yǎng)成分（見(jiàn)表2）

表2 蓮葉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分

2.2 蓮葉體外培養(yǎng)發(fā)酵指標(biāo)（見(jiàn)表3）

由表3可見(jiàn)：試驗(yàn)組干物質(zhì)消化率（59.13%）高于對(duì)照組干物質(zhì)消化率（48.75%），說(shuō)明蓮葉具有較高飼用價(jià)值；試驗(yàn)組產(chǎn)氣量(43.5 ml)高于對(duì)照組產(chǎn)氣量（30 ml）；試驗(yàn)組瘤胃菌體蛋白含量（5.93 mg/100 ml）高于對(duì)照組（4.06 mg/100 ml）；試驗(yàn)組氨態(tài)氮產(chǎn)量(8.78 mg/100 ml)高于對(duì)照組（8.36 mg/100 ml）；試驗(yàn)組pH值(5.86)低于對(duì)照組（6.06）；試驗(yàn)組VFA產(chǎn)量(28.31 mmol/l)高于對(duì)照組（21.48 mmol/l）；試驗(yàn)組支鏈脂肪酸產(chǎn)量(0.44 mmol/l)與對(duì)照組（0.44 mmol/l）產(chǎn)量相等；試驗(yàn)組乙酸/丙酸比值(1.98)低于對(duì)照組（2.43）；試驗(yàn)組乙酸產(chǎn)量（16.87 mmol/l）高于對(duì)照組乙酸產(chǎn)量（13.34 mmol/l）；試驗(yàn)組丙酸產(chǎn)量（8.53 mmol/l）高于對(duì)照組丙酸產(chǎn)量（5.49 mmol/l）；試驗(yàn)組丁酸產(chǎn)量（2.47 mmol/l）高于對(duì)照組丁酸產(chǎn)量（2.21 mmol/l）；試驗(yàn)組異丁酸產(chǎn)量（0.25 mmol/l）高于對(duì)照組異丁酸產(chǎn)量（0.22 mmol/l）；試驗(yàn)組異戊酸產(chǎn)量（0.19 mmol/l）低于對(duì)照組異戊酸產(chǎn)量（0.22 mmol/l）。

表3 蓮葉體外培養(yǎng)發(fā)酵指標(biāo)

3 討論

瘤胃pH值是一項(xiàng)反映瘤胃發(fā)酵水平最基本、最重要的指標(biāo)之一,對(duì)維持瘤胃內(nèi)環(huán)境相對(duì)恒定起到主導(dǎo)作用。pH值受很多因素的影響，如唾液分泌、VFA的吸收和排出速度等，其波動(dòng)根本原因則是日糧結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)成分。適宜pH值才可使瘤胃正常發(fā)酵。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)于瘤胃微生物最適宜的生長(zhǎng)范圍有許多研究，一般認(rèn)為瘤胃原蟲(chóng)、厭氧性真菌和細(xì)菌最適pH值為5.8、7.5和6～7。纖維素消化最適pH范圍6.0～6.8。VFA形成適宜pH范圍6.2～6.6。蛋白質(zhì)合成最佳pH值范圍6.3～7.4。NH3-N利用最適pH值范圍5.7～6.2。本試驗(yàn)結(jié)果表明：試驗(yàn)組pH值（5.86）低于對(duì)照組（6.06），由于沒(méi)有瘤胃壁對(duì)酸的流入和排出，唾液的分泌也不存在，隨著時(shí)間延長(zhǎng)人工培養(yǎng)液逐漸失效，因此導(dǎo)致pH值偏低。

在反芻動(dòng)物中，瘤胃微生物將日糧中的蛋白分解為小肽、氨基酸和氨等多種形式的氮，然后在碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)下，將這些氮合成微生物蛋白，然后進(jìn)入后消化道進(jìn)行消化、吸收和利用。因此，瘤胃中BCP是反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)最重要來(lái)源，能提供蛋白質(zhì)需要的40%～80%。菌體蛋白濃度高低從側(cè)面反映發(fā)酵系統(tǒng)中微生物種群的數(shù)量及氨態(tài)氮的使用情況。本試驗(yàn)結(jié)果表明：試驗(yàn)組菌體蛋白濃度（5.93 mg/100 ml）高于對(duì)照組（4.06 mg/100 ml）,試驗(yàn)組有利于瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成。Mc Allan等（1994）研究發(fā)現(xiàn)提高粗蛋白降解可以增加菌體蛋白合成，本試驗(yàn)因蓮葉粗蛋白含量高（19.10%），促進(jìn)菌體蛋白合成。

VFA含量是瘤胃發(fā)酵的主要指標(biāo)之一。反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生VFA約占進(jìn)入機(jī)體代謝的碳流量的2/3,可提供總能量需要量的70%～80%。VFA的含量及比例可大致反映瘤胃內(nèi)的發(fā)酵類(lèi)型和吸收狀況。VFA的產(chǎn)量和比例和許多因素有關(guān)：①瘤胃微生物種類(lèi)及數(shù)量改變也會(huì)影響VFA產(chǎn)量及比例，不同種類(lèi)的微生物對(duì)底物的發(fā)酵類(lèi)型及代謝途徑都不相同，不同飼喂條件下，瘤胃微生物組成和數(shù)量也會(huì)改變；②瘤胃內(nèi)環(huán)境改變也會(huì)改變VFA產(chǎn)量及比例；③不同底物發(fā)酵其VFA產(chǎn)量及比例也會(huì)不同。本試驗(yàn)結(jié)果表明：試驗(yàn)組VFA產(chǎn)量高于對(duì)照組，蓮葉做體外發(fā)酵底物有利于瘤胃VFA的合成。

乙酸/丙酸比例是反映瘤胃發(fā)酵類(lèi)型和能量利用率的主要指標(biāo)，乙酸/丙酸比例越低，說(shuō)明瘤胃朝丙酸型發(fā)酵，反芻動(dòng)物能量利用效率就越高。丙酸為主要生糖VFA，對(duì)于育肥牛丙酸產(chǎn)量高較好。乙酸是合成脂肪的前體物質(zhì)，奶牛生產(chǎn)中乙酸產(chǎn)量高較好。本試驗(yàn)表明：試驗(yàn)組乙酸/丙酸比值低于對(duì)照組，說(shuō)明瘤胃朝丙酸型發(fā)酵，瘤胃對(duì)蓮葉中能量利用率較高，蓮葉在瘤胃中發(fā)酵消化較快。

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)NH3-N是重要的中間產(chǎn)物，是微生物合成菌體蛋白的主要氮源，氨態(tài)氮主要來(lái)源是飼料重含氮物質(zhì)的發(fā)酵，瘤胃氨氮濃度反映氮源供應(yīng)情況。瘤胃纖維降解細(xì)菌生長(zhǎng)需要NH3-N刺激，當(dāng)飼料中氮過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致瘤胃微生物特別是纖維分解菌生長(zhǎng)不好，導(dǎo)致瘤胃發(fā)效率降低，纖維分解效率下降，微生物蛋白合成受阻，當(dāng)含氮物質(zhì)過(guò)高，超過(guò)微生物利用最大能力，導(dǎo)致氮源浪費(fèi)，嚴(yán)重還會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物氨中毒。Satter等(1974)研究表明，5 mg/100 ml為瘤胃氨態(tài)氮濃度最低標(biāo)準(zhǔn)，小于這個(gè)濃度，瘤胃微生物不能正常生長(zhǎng)。Wanapat等（1998）研究表明5～28 mg/100 ml內(nèi)氨態(tài)氮濃度適宜瘤胃微生物生長(zhǎng)。本試驗(yàn)氨態(tài)氮濃度在此范圍內(nèi)，試驗(yàn)組高于對(duì)照組，說(shuō)明蓮葉提供氮源充足，微生物生長(zhǎng)較好。

支鏈脂肪酸(BCFA)是瘤胃內(nèi)纖維分解菌的生長(zhǎng)因子,可提高纖維分解菌的數(shù)量,促進(jìn)纖維消化。瘤胃中支鏈脂肪酸主要來(lái)源于蛋白質(zhì)降解后氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)經(jīng)氧化脫氨基或脫羧基后的產(chǎn)物。本試驗(yàn)表明：試驗(yàn)組支鏈脂肪酸與對(duì)照組相等，說(shuō)明蓮葉為體外培養(yǎng)底物不能促進(jìn)纖維消化。

4 小結(jié)

4.1 蓮葉體外培養(yǎng)法測(cè)得干物質(zhì)消化率高達(dá)59.13%,說(shuō)明蓮葉具有較高飼用價(jià)值。

4.2 蓮葉能提高瘤胃發(fā)酵功能，促進(jìn)瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成和瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生，促進(jìn)瘤胃丙酸型發(fā)酵。

（參考文獻(xiàn)25篇，刊略，需者可函索）