中國(guó)漢族人群apoB VNTR 等位基因的多態(tài)性分析及其分型標(biāo)準(zhǔn)物的克隆制備

駱曉楓 洪瑩芬 何 江 單翼龍 黎揚(yáng)斯 林建勛 謝金衛(wèi) 周俊宜 周俊梅

載脂蛋白B(apoB)基因位于2 號(hào)染色體的短臂(2p23)，基因總長(zhǎng)度為43kb。該基因3'端下游具有一個(gè)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)，由14 ～16bp長(zhǎng)、富含AT 二核苷酸的重復(fù)序列串聯(lián)而成［1］。這些串聯(lián)重復(fù)序列的拷貝數(shù)目以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化構(gòu)成了apoB VNTR 等位基因的高度多態(tài)性。根據(jù)串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)目的不同，目前已發(fā)現(xiàn)有22 種等位基因，長(zhǎng)度為400 ～1200bp［2～4］。apoB VNTR 所具有的高度多態(tài)性和高度雜合性，使其不僅可以作為遺傳性標(biāo)志，用于研究人類的起源、進(jìn)化和遷徙［5～7］，還在個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定等法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有很高的應(yīng)用價(jià)值［6，8］。此外，apoB VNTR 等位基因在心肌梗死、血漿LDL 水平和高膽固醇血癥等疾病的基因連鎖分析、臨床及流行病學(xué)研究上有一定的研究意義［9～12］。

筆者對(duì)廣州地區(qū)大學(xué)生漢族人群進(jìn)行了apoB VNTR 等位基因的檢測(cè)，調(diào)查其分型及分布頻率，并通過(guò)測(cè)序等方法分析其基因序列的組成特點(diǎn)，以期獲得更全面的基因多態(tài)性信息。此外，筆者利用分子克隆技術(shù)將所獲得的apoB VNTR 等位基因制備成分型標(biāo)準(zhǔn)物(allelic ladder)。目前最常用的apoB VNTR等位基因檢測(cè)方法是將PCR 擴(kuò)增與凝膠電泳聯(lián)用，通過(guò)計(jì)算PCR 產(chǎn)物的電泳遷移率估算相對(duì)分子質(zhì)量來(lái)進(jìn)行基因分型［13］。這種方法依賴于相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照，由于apoB VNTR 各等位基因間相對(duì)分子質(zhì)量的差異最小僅為30bp，而等位基因的長(zhǎng)度范圍為400 ～1200bp，市售的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品很難滿足檢測(cè)的需要，容易造成分型的不準(zhǔn)確。制備出apoB VNTR 等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物，可以用來(lái)與未知樣品比對(duì)確定基因型，使得檢測(cè)更為精確化、標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在各實(shí)驗(yàn)室之間能更方便進(jìn)行比對(duì)。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象:按照知情同意的原則，采集廣州地區(qū)大學(xué)生漢族無(wú)關(guān)個(gè)體366 人的生理鹽水漱口液，全部樣品均在采集當(dāng)天進(jìn)行基因組DNA 的提取。

2.方法:(1)口腔黏膜上皮細(xì)胞模板DNA 提取:吸取生理鹽水漱口液10ml 置于離心管，高速冷凍離心機(jī)(SIGMA)8000r/min 離心10min 得到口腔黏膜上皮細(xì)胞，采用酚-氯仿的方法提取基因組DNA。將口腔黏膜上皮細(xì)胞重懸于0.5ml抽提緩沖液(100mmol/L Tris，50mmol/L EDTA，200mmol/L NaCl，0.5% SDS，200μg/ml 蛋白酶K，pH 8. 0)，65℃水浴30min 進(jìn)行細(xì)胞裂解，然后依次使用等體積的飽和酚、酚∶氯仿(1∶1)和氯仿∶異戊醇(24∶1)，對(duì)上述細(xì)胞裂解液分別抽提1 次去除雜質(zhì)，最后用乙醇洗淀DNA 并干燥，加入適量TE緩沖液溶解，紫外吸收法測(cè)定和計(jì)算DNA 的濃度和純度。(2)引物合成:PCR 擴(kuò)增引物由上海鉑尚生物技術(shù)公司合成，引物序列參照羅超權(quán)等［8］為上游引物:5' - ATGGAAACGGAGAAATTATG - 3';下游引物:5' - CCTTCTCACTTGGCAAATAC-3'。(3)PCR 擴(kuò)增:使用TaKaRa 公司的premix taq PCR 試劑盒。反應(yīng)體系總體積為30μl:DNA 模板約0.3 ～0.5μg，premix tap 15μl(Taq1.25U，dNTP 各0. 4mmol/L，2 ×PCR Buffer)，上下游引物各0.5μl(10μmol)，用蒸餾水補(bǔ)足至30μl。擴(kuò)增使用HEMA3200 型PCR 擴(kuò)增儀，擴(kuò)增程序?yàn)閮刹窖h(huán)法:94℃預(yù)變性7min，94℃變性1min，60℃退火及延伸共4min，30 個(gè)循環(huán)，最后60℃保溫10min。(4)常規(guī)電泳分型:擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，80mA 恒流電泳8h 后，凝膠成像儀拍照電泳結(jié)果，并通過(guò)軟件分析其電泳遷移率估算相對(duì)分子質(zhì)量來(lái)進(jìn)行分型。(5)群體遺傳學(xué)分析:用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算確定廣州地區(qū)大學(xué)生漢族群體apoB VNTR 各等位基因的分布及其基因頻率分布。(6)DNA 測(cè)序:DNA 測(cè)序由廣州華大基因公司完成。(7)擴(kuò)增產(chǎn)物回收及鑒定:從群體樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物中，選出不同大小片段長(zhǎng)度的apoB VNTR 等位基因，為防止常規(guī)電泳的錯(cuò)誤分型，每種等位基因均有3 個(gè)以上來(lái)自不同個(gè)體的片段。用DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京百泰克公司)回收純化各個(gè)片段?；厥掌芜M(jìn)行DNA 測(cè)序，通過(guò)測(cè)序結(jié)果來(lái)確定正確的等位基因類型。(8)PCR 產(chǎn)物的克隆:采用pMD-19T PCR 產(chǎn)物克隆試劑盒(TaKaRa 公司)，將純化并測(cè)序確定的等位基因片段插入pMD19 質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)，重組后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，瓊脂平板培養(yǎng)劃線法挑取單克隆菌落，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，使用質(zhì)粒純化試劑盒(TaKaRa 公司)得到含apoB VNTR 各等位基因的質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA 測(cè)序確定插入片段的類型并命名。(9)等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的制備和再鑒定:含有正確等位基因插入片段的重組質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、純化后，以其作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系及條件如步驟3。凝膠回收純化各等位基因的PCR 產(chǎn)物，混合制備成等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物階梯，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證所得標(biāo)準(zhǔn)分型物的可用性。

結(jié) 果

1.群體樣本中的等位基因種類:從366 例廣州地區(qū)漢族大學(xué)生人群樣本中總共得到16 種apoB VNTR等位基因，以核心序列重復(fù)次數(shù)命名這些等位基因?yàn)镠VE28、HVE30、HVE32、HVE34、HVE36、HVE38、HVE40、HVE42、HVE44、HVE46、HVE48、HVE50、HVE52、HVE54、HVE56、HVE58。

2.等位基因分布及基因頻率分布:對(duì)366 例廣州地區(qū)漢族大學(xué)生人群樣本的調(diào)查結(jié)果顯示，apoB 基因VNTR 16 種等位基因呈正態(tài)分布，頻率最高的集中在HVE30 ～HVE38，其中又以HVE34 最為常見(jiàn)，頻率為49.19%，其次為HVE36，頻率為22.54%(表1)。

表1 廣州地區(qū)漢族大學(xué)生人群apoB VNTR 等位基因分布

3. apoB VNTR 等位基因的序列分析:對(duì)apoB VNTR 各等位基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明ApoB VNTR 序列由前端72bp 和末端80bp 的保守序列以及中間的重復(fù)序列構(gòu)成(圖1 為等位基因HVE28 的測(cè)序結(jié)果圖譜)。觀察到重復(fù)序列主要為兩類核心序列，與Ludwig 等［2］報(bào)道的一致，一類是ATAATTAAATATTTT，稱為X 型，另一類是ATAATTAAAATATTT，稱為Y 型。但重復(fù)序列并非全為這兩種核心序列的依次間隔排列，筆者觀察到16 種等位基因的X 型和Y 型核心序列排列次序在靠近兩端的區(qū)域存在差異。

圖1 HVE28 的測(cè)序結(jié)果圖譜

同時(shí)在測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，某些重復(fù)序列中可發(fā)生單核苷酸取代而產(chǎn)生的變異體，不僅有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的G 或C 取代T，還發(fā)現(xiàn)A、T 相互調(diào)換的現(xiàn)象，以下為發(fā)現(xiàn)的變異體序列:ATAATTAAAATTTTT、ATAATAAAATATTTT、ATA ATTACATATTTT、ATAATTCAATATTTT、ATAATTAAAATGTTT 和ATAATTAAAGTATTT［3］。

4.等位基因階梯的制備及應(yīng)用:以分別插入16種apoB VNTR 等位基因的重組質(zhì)粒為PCR 擴(kuò)增的模板，對(duì)各等位基因分別進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化并測(cè)定濃度后，混合制備成apoB VNTR 等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物階梯，長(zhǎng)度范圍為572 ～1022bp(圖2)。與常規(guī)電泳分型方法相比較，使用等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物階梯更加簡(jiǎn)單快速，無(wú)須使用煩瑣的電泳遷移率方法計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量，可以直接在電泳圖譜中讀出樣本所屬的等位基因型(圖3)。

圖2 apoB VNTR 等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物電泳分型結(jié)果

圖3 使用等位基因標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行的apoB VNTR 分型的電泳結(jié)果

討 論

筆者調(diào)查了在廣州地區(qū)漢族大學(xué)生人群中apoB VNTR 的基因型分布，在366 例樣本中總共發(fā)現(xiàn)了16 種等位基因。其中以HVE34 基因型最為常見(jiàn)，頻率為49.19%，其次為HVE36，頻率為22.54%。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的漢族人群apoB VNTR 等位基因頻率分布的研究結(jié)果存在差異，如陳保生等［14］研究的漢族人群以HVE36 最多，頻率為27.8%，HVE34 次之，為22.2%。張樂(lè)等［15］研究的漢族人群則以HVE32 最多，頻率為38.5%，HVE34次之，為20.5%。本研究與相關(guān)文獻(xiàn)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)頻率最高類型均不同，各優(yōu)勢(shì)等位基因的頻率差異也較大，分析原因可能為:①apoB VNTR 等位基因頻率分布可能在不同地區(qū)間存在差異;②實(shí)驗(yàn)方法的精確性，導(dǎo)致分型結(jié)果有差異。此外，本研究分析了16 種等位基因的測(cè)序結(jié)果，觀察到apoB VNTR 的X 型和Y 型核心序列存在發(fā)生單核苷酸取代而產(chǎn)生的變異體，不僅有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的G 或C 取代T，還發(fā)現(xiàn)A、T相互調(diào)換的現(xiàn)象，這說(shuō)明apoB VNTR 等位基因的多態(tài)性不僅體現(xiàn)在序列長(zhǎng)度上，同時(shí)還可能存在堿基組成上的多態(tài)性，這需要更深入的研究來(lái)證實(shí)［3］。

筆者采用分子克隆技術(shù)在國(guó)內(nèi)首先制備出包含中國(guó)漢族人群apoB VNTR16 種等位基因片段的分型標(biāo)準(zhǔn)物，使用效果良好。目前對(duì)apoB VNTR 等位基因進(jìn)行分型的最好方法是測(cè)序法，可以清楚地了解到核心序列結(jié)構(gòu)和串聯(lián)重復(fù)次數(shù)，但一般實(shí)驗(yàn)室無(wú)力購(gòu)買(mǎi)昂貴的測(cè)序儀，樣品送到技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序的途徑并不便捷。因此大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室仍然采用常規(guī)電泳法，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物的對(duì)照來(lái)估算等位基因片段的序列長(zhǎng)度。由于apoB VNTR 的核心序列僅14 ～16bp，等位基因的片段最大在1000bp 以上，目前并沒(méi)有在階梯間隔和大小范圍上有符合要求的市售標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物，只能使用一般的標(biāo)準(zhǔn)物來(lái)代替，容易發(fā)生偏差，難以得到準(zhǔn)確分型。因此，建立一套精確的分型標(biāo)準(zhǔn)參照物，才有可能對(duì)apoB VNTR 分型結(jié)果作出快速而正確的判斷，并在不同實(shí)驗(yàn)室之間得到可重復(fù)性的結(jié)果。目前較常用的制備等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)參照物的方法主要有簡(jiǎn)單PCR 擴(kuò)增法和分子克隆技術(shù)制備法［16］。簡(jiǎn)單PCR 擴(kuò)增法步驟簡(jiǎn)便，但是制備出的分型標(biāo)準(zhǔn)物穩(wěn)定性差，不易長(zhǎng)期保存。而用分子克隆技術(shù)制備出等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物具有突出的穩(wěn)定性，可大量生產(chǎn)，并能建立等位基因片段重組質(zhì)粒庫(kù)，保證了分型標(biāo)準(zhǔn)物的永久同一性，是簡(jiǎn)單PCR 擴(kuò)增法不可比擬的。因此，為使不同實(shí)驗(yàn)室間的apoB VNTR 檢測(cè)數(shù)據(jù)得以正確比較，使用等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物是一種非常有效的方法。

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