奧沙利鉑對原發(fā)性肝癌細(xì)胞系HUH-7的抗腫瘤效果評價

樸蓮淑 王迎春

大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧大連 116001

奧沙利鉑對原發(fā)性肝癌細(xì)胞系HUH-7的抗腫瘤效果評價

樸蓮淑 王迎春

大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧大連 116001

目的探討奧沙利鉑對原發(fā)性肝癌細(xì)胞系HUH-7是否會產(chǎn)生作用和影響，根據(jù)其對抗腫瘤的效果決定是否能夠應(yīng)用于對肝癌細(xì)胞的臨床治療。方法把中科院2012年3月—2014年4月的肝癌細(xì)胞作為該試驗(yàn)的研究對象，用流式細(xì)胞儀器對癌細(xì)胞的分布周期和死亡狀況進(jìn)行分析，運(yùn)用MTT法測試不同濃度和不同的作用時間的奧沙利鉑對肝癌細(xì)胞增長繁殖的抑制效果。通過多次試驗(yàn)，得出最終結(jié)論。結(jié)果經(jīng)過48 h作用后，癌細(xì)胞死亡率達(dá)到了11.8%，可見奧沙利鉑對于肝癌細(xì)胞的繁衍增長有著很強(qiáng)的抑制功效，并且呈現(xiàn)出計(jì)量和時間的依賴性。結(jié)論奧沙利鉑對原生性肝癌細(xì)胞系HUH-7的抗瘤效果明顯，它可以抑制肝癌細(xì)胞繁殖，使細(xì)胞周期停留在S期和G2PM期之間，進(jìn)而使癌細(xì)胞死亡。但是其具體的運(yùn)行機(jī)制還有待研究，因而奧沙利鉑能否應(yīng)用于臨床治療還不能蓋棺定論。

奧沙利鉑；原發(fā)性；肝癌細(xì)胞；效果

原發(fā)性肝癌對人身體危害極大，且不易治愈。傳統(tǒng)的治療方法以手術(shù)為主，化療為輔。但是，這一治療方式有很大不足之處。有很多肝癌患者發(fā)現(xiàn)自己的病情、進(jìn)行治療時肝癌已經(jīng)發(fā)展到晚期，不能進(jìn)行手術(shù)，因?yàn)榇藭r的病人的體制已經(jīng)太差，經(jīng)不起手術(shù)的折騰。而且，近幾年肝癌患者在經(jīng)過手術(shù)治療后，肝癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的幾率也越來越大。癌細(xì)胞的抗藥性很強(qiáng)，不利于患者的術(shù)后化療康復(fù)。因此，必須要找到一種能防止腫瘤轉(zhuǎn)移增殖的中藥來輔助治療。這樣一來，肝癌的中西醫(yī)聯(lián)合治療法就成為一種十分有益的輔佐方法。

大量的臨床資料顯示，奧沙利鉑對于多種類型腫瘤的治療都有很好的效果。它可以有效抑制癌細(xì)胞再生，且很安全無不良反。但是卻很少有人研究奧沙利鉑在人體內(nèi)對肝癌細(xì)胞的影響。在該研究里，把中科院2012年3月—2014年4月的肝癌細(xì)胞作為該試驗(yàn)的研究對象，就對這一問題進(jìn)行研究，為它的臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細(xì)胞株QGY 由中科院細(xì)胞生物研究所提供的細(xì)胞株。這些細(xì)胞株是在含有15%胎牛血清RPMI1640營養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2環(huán)境下而培養(yǎng)出的。

1.1.2 試劑 分子量是396.97的奧沙利鉑，在使用時，可以用濃度為5%的葡萄糖注射液稀釋其濃度至所需濃度。胎牛血清。MTT，即甲基偶氮唑鹽。發(fā)生突變的Bax、Fas、P53等。

1.1.3 主要儀器 型號為HITACH-I600透視型電子顯微鏡 （日本）、型號為BIO-RAD2550的全自動酶標(biāo)讀數(shù)儀器（美國）、倒置顯微鏡（日本）、流式細(xì)胞儀（美國）。

1.2 方法

1.2.1 檢測奧沙利鉑對細(xì)胞株的影響的方法 使用甲基偶氮唑鹽比色的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用1.1%的胰蛋白酶將所選取的QGY細(xì)胞株進(jìn)行消化，再放入胎牛血清濃度為15%的培養(yǎng)液中，將細(xì)胞株制成50 000/mL濃度的細(xì)胞液。并以200l1每孔的分量在96個培養(yǎng)板中進(jìn)行接種。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，培養(yǎng)時間分別是1 d、2 d。達(dá)到培養(yǎng)時間后，再取出原液，加入一定比例的培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 檢測奧沙利鉑對癌細(xì)胞周期的作用的方法 用流式細(xì)胞儀器進(jìn)行分析。把濃度為71%的乙醇加入到取得的細(xì)胞中用PI進(jìn)行染色30 min。并用流式細(xì)胞儀器分析細(xì)胞周期的變化和肝癌細(xì)胞的死亡狀況。

1.2.3 檢測奧沙利鉑對基因蛋白的影響的方法 用免疫組織化學(xué)方法，對細(xì)胞株進(jìn)行特殊培養(yǎng)，觀察其染色情況，按公式計(jì)算出相應(yīng)的HSCORE得分。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 奧沙利鉑對細(xì)胞的作用

奧沙利鉑能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的增長，而且對劑量有很強(qiáng)的依賴作用，藥物的濃度越高，抑制作用越強(qiáng)；對時間也有依賴作用，抑制作用隨著藥物作用時間的增長而增長。即奧沙利鉑的濃度不同或者時間作用不同對肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的影響程度也不同。見表1。

表1 比色（MTT）法檢驗(yàn)出的奧沙利鉑對癌細(xì)胞的影響（）

表1 比色（MTT）法檢驗(yàn)出的奧沙利鉑對癌細(xì)胞的影響（）

奧沙利鉑濃度24 h 48 h FP 16LmolPL 32LmolPL 64LmolPL 128 LmolPL 0.189 8±0.056 0.213 5±0.038 2 0.275 2±0.075 0.0173±0.817 7 0.390 2±0.013 5 0.607 1±0.061 9 0.743 2±0.016 4 0.817 6±0.041 4 348.178＜0.02

2.2 奧沙利鉑對細(xì)胞株周期和死亡情況的影響

奧沙利鉑對肝癌細(xì)胞作用時間達(dá)到24 h后，癌細(xì)胞周期基本都停在了S周期；在作用時間達(dá)到48 h后，細(xì)胞周期就被迫停在了S期和G2PM期之間，但仍主要在停在S期。而且奧沙利鉑作用于肝癌細(xì)胞24 h、48 h后，肝癌細(xì)胞死亡率分別是6.27%、11.8%，由此可見，隨著奧沙利鉑作用時間的增長，肝癌細(xì)胞的死亡率也在增長。

2.3 奧沙利鉑對相關(guān)基因蛋白的影響

使用奧沙利鉑后，Cyclin A定位在胞核中;MTP53陽性表達(dá)見于胞核 ;Bc-l 2、Bax及Fas定位在胞漿中;Myc的陽性表達(dá)于胞漿和胞核可見。奧沙利鉑作用于癌細(xì)胞72 h后,免疫細(xì)胞化學(xué)表Cyclin A、Bax表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.03),MTP53、Bc-l 2及Myc表達(dá)減弱(P＜0.02),Fas表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.06)。見表2。

表2 奧沙利鉑對QGY細(xì)胞周期蛋白及凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響（）

表2 奧沙利鉑對QGY細(xì)胞周期蛋白及凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響（）

醫(yī)抗體標(biāo)本抑制奧沙利鉑表達(dá)方法 P細(xì)胞周期蛋白Cyclin A MTP53 Bc-l Bax Myc Fas 20 2.820±0.020 2.935±0.019 0.019＜0.01 20 20 20 20 20 2.771±0.009 2.787±0.005 2.367±0.102 2.675±0.007 2.686±0.011 2.502±0.007 2.669±0.005 2.726±0.005 2.520±0.008 2.675±0.029 0.007 0.005 0.005 0.008 0.029＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05

3 討論

在該研究中，采取了兩種方法對奧沙利鉑對癌細(xì)胞的作用進(jìn)行了研究，有兩個重大發(fā)現(xiàn)：一是藥物作用于癌細(xì)胞48 h后，將癌細(xì)胞阻斷在S期和G2PM期之間，使癌細(xì)胞死亡率達(dá)到了11.8%；二是奧沙利鉑濃度為16 mol/L作用24 h影響為（0.189 8± 0.056），濃度為升為128 mol/L作用48 h影響升為了（0.817 6± 0.041 4）。實(shí)驗(yàn)表明：奧沙利鉑對癌細(xì)胞有影響，能夠?qū)⒏伟┘?xì)胞全部停留在S期和G2PM期之間，并逐步產(chǎn)生作用，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞走向凋亡。且奧沙利鉑對肝癌細(xì)胞起的作用大小呈現(xiàn)出對劑量、時間的依賴性。

大量歷史資料[2-3]表明：很多抗癌的藥品不會直接消滅肝癌細(xì)胞而是通過誘導(dǎo)機(jī)制使其逐步走向死亡，因?yàn)榭拱┧幬镌谙麥绨┘?xì)胞的同時可能會對正常的細(xì)胞產(chǎn)生不良作用。因而，研究新型的能誘導(dǎo)癌細(xì)胞自動凋亡的抗癌藥物是現(xiàn)代抗癌治療的新渠道。而奧沙利鉑是第3代鉑化合物，它能夠中斷DNA的合成，從而使癌細(xì)胞失去存活、增殖的基礎(chǔ)，有效抑制癌細(xì)胞增長，誘導(dǎo)其凋亡。

實(shí)驗(yàn)證明，奧沙利鉑可以應(yīng)用于肝癌的臨床治療，而且能夠取得很好的效果，是未來抗癌的一種重要的藥物。進(jìn)一步對其進(jìn)行開發(fā)研究，進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，使其得到廣泛的臨床應(yīng)用是醫(yī)學(xué)界的重要課題。

[1]高潔，汪蕊，楊清玲，等.奧沙利鉑對肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013（4）：437-442.

[2]高潔，吳窮，楊清玲，等.奧沙利鉑對肝癌細(xì)胞HuH-7細(xì)胞周期的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012,41（4）：445-449.

[3]王中煥，楚建軍，張福正，等.塞來昔布對人肝癌細(xì)胞增殖抑制及放療增敏作用[J].實(shí)用癌癥雜志，2012,27（1）：15-17.

[4]秦琴萊，智勇，高然朋，等.載脂蛋白ApoE修飾脂質(zhì)體對肝癌細(xì)胞的靶向轉(zhuǎn)染[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2014,31（8）：1709-1711.

[5]郭國英，謝國良，何國，等.HSV-tk聯(lián)合GCV自殺系統(tǒng)對肝癌細(xì)胞株Huh-7殺傷作用的研究[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào),2011,28（2）：246-250.

[6]鄭大勇，阮健，劉斐燁，等.RNA干擾GPC3基因表達(dá)影響肝癌細(xì)胞Huh-7凋亡的機(jī)制研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2011,11（5）：516-519.

[7]紀(jì)輝.RNA干擾YES相關(guān)蛋白基因?qū)Ω伟┘?xì)胞Huh-7增殖和凋亡的影響[D].蘇州：蘇州大學(xué)，2012.

[8]許榮華，鄭武平，夏立平.抑癌基因fhit對肝癌細(xì)胞HuH-7體內(nèi)外生長的影響[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010（2）：131-135.

Oxaliplatin for hepatocellular carcinoma cell line HUH-7 anti-tumor effect of the evaluation

PU lianShu WANG Yingchun
Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian Medical University,Dalian,Liaoning Province,116001 China

ObjectiveTo observe the effect of oxaliplatin on hepatocellular carcinoma cell line HUH-7 will produce the effect and influence,according to the anti-tumor effect decided whether to apply in the clinical treatment ofhepatocellular carcinoma cells.MethodsHepatoma cells as the object of study in this experiment,the distribution of cancer cell cycle were analyzed by flow cytometry instrument and death situation,using MTT method to test the inhibitory effect of different concentrations and different action time of oxaliplatin on hepatocellular carcinoma cell growth and reproduction of.Through many experiments,and draw the final conclusion.ResultsAfter 48 hours after the action of cancer cell death rate reached 11.8%,visible Asha Leigh Per has a very strong inhibitory effect on liver cancer cells multiplygrowth,and presents the measurement and time dependence.ConclusionAnti tumoreffect conclusion oxaliplatin on primary hepatocellular carcinoma cell line HUH-7 is obvious,it can inhibit the hepatoma cell reproduction,so that the cell cyclehere between the S phase and G2PM phase,and then make the death of cancer cells.But the specific operation mechanism remains to be studied,which could be used in the clinical treatment of oxaliplatin is not conclusive.

Asha Leigh Per;Primary;Hepatocellular carcinoma cell;Effect

R735

A

1674-0742（2015）02（c）－0089-03

2014-11-18）

樸蓮淑(1979.6-)，女，朝鮮族，吉林舒蘭人，博士，主治醫(yī)師，研究方向：肝硬化基因研究與干細(xì)胞治療，原發(fā)性肝癌基因研究與腫瘤肝細(xì)胞研究。