閃式提取法用于大蝎子草總黃酮的工藝條件研究

李桂蘭， 賀智勇， 薛雨晨， 吳林菁， 陶 玲*， 沈祥春*

（1.貴陽醫(yī)學院中藥藥劑教研室，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學院天然藥物優(yōu)效利用重點實驗室，貴州貴陽550004）

閃式提取法用于大蝎子草總黃酮的工藝條件研究

李桂蘭1，2， 賀智勇1，2， 薛雨晨1，2， 吳林菁1，2， 陶 玲1，2*， 沈祥春1，2*

（1.貴陽醫(yī)學院中藥藥劑教研室，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學院天然藥物優(yōu)效利用重點實驗室，貴州貴陽550004）

目的探索有效的大蝎子草總黃酮提取方法。方法比較回流提取、閃式提取兩種方法，及水和乙醇分別作為溶劑提取大蝎子草總黃酮的效果，并采用正交試驗設計，對閃式提取大蝎子草總黃酮工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果閃式提取大蝎子草總黃酮最佳工藝為蒸餾水溫度60℃，料液比1∶75，提取時間為4 min，閃提轉(zhuǎn)速4 000 r/min，提取率為9.093 mg/g，優(yōu)于乙醇為溶劑的回流提取法。結(jié)論閃式提取法操作簡便、高效經(jīng)濟，與回流提取法相比，采用閃式提取法并用熱水作溶劑提取大蝎子草總黃酮取得較好效果。

大蝎子草；總黃酮；閃式提?。徽辉囼?/p>

大蝎子草Girardinia diversifolia（Link）Friis.的全草或根作為貴州苗族民間用藥歷史悠久，在 《貴州中草藥名藥》《滇藥錄》 《藏本草》 《四川常用草藥》等均有記載，味苦、辛，性涼，有小毒，主要用于治療中風不語、咳嗽多痰、風濕疼痛、跌打損傷、骨折等［1-2］。蕁麻屬植物生態(tài)學和藥效學及臨床等方面研究較多，但大蝎子草的提取工藝研究尚未見報道［3-6］。

閃式提取法是近年發(fā)展起來的一種用于中草藥提取的高新技術，該設備以組織破碎原理為基礎，具有快速、高效、充分、完全提取、操作簡便的特點，而且節(jié)省能源，有效保護了提取物質(zhì)中的熱敏性成分，與傳統(tǒng)提取方法相比具有非常顯著的優(yōu)勢。

本研究以大蝎子草中抗炎有效成分總黃酮含有量為指標，進行不同提取方法和不同溶劑對大蝎子草總黃酮提取率影響的考察，探討并采用正交試驗設計對閃式提取工藝條件進行研究，為大蝎子草中有效成分的提取提供簡便、快捷的方法。

1 儀器與試藥

JHBE-50S閃式提取控制器 （北京金鼎科技發(fā)展有限公司）；UV2401PC紫外可見分光光度計 （島津）；FA20304電子分析天平 （上海恒平科學儀器有限公司），托盤天平（上海光正醫(yī)療器械有限公司）；

芹菜素對照品 （中國食品藥品檢定研究院，純度大于98%）；乙醇為分析純。大蝎子草藥材采集于貴州省貴陽市花溪區(qū)，經(jīng)貴陽醫(yī)學院生藥學與藥用植物學教研室龍慶德副教授鑒定為蕁麻科蝎子草屬植物大蝎子草Girardinia diversifolia（Link）Friis.的地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的測定

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取芹菜素對照品5 mg，置25 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，即得0.20 mg/mL的芹菜素對照品貯備液。

2.1.2 最大吸收波長的確定 以乙醇為空白對照，采用紫外可見分光光度計，分別在波長為190～400 nm區(qū)間掃描芹菜素對照品和大蝎子草供試樣，結(jié)果表明，二者均在在268 nm波長附近有最大吸收，故選擇最大吸收波長為268 nm［7］。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密移取對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別置于50 mL量瓶中，乙醇定容，得到質(zhì)量濃度分別為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0μg/mL的對照品供試液。采用紫外可見分光光度計在268 nm波長下測定吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標制備標準曲線，得到回歸方程Y= 0.035 5X+0.001 1，相關系數(shù)r=0.999 7。結(jié)果表明芹菜素在2.0～12.0μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.4 精密度試驗 精密移取對照品溶液1 mL于25 mL的量瓶中，乙醇定容，紫外可見分光光度計在268 nm處測定吸光度，重復測定6次，計算得RSD為0.23%，表明精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 精密移取供試品溶液1 mL于25 mL的量瓶中，乙醇定容，搖勻，分別在0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、24 h于268 nm波長處用紫外可見分光光度計測定吸光度，并計算其前8 h的RSD為8.6%，前6 h的RSD為2.2%，說明樣品在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復性試驗 精密移取6份1 mL供試溶液置于25 mL量瓶中，分別用紫外可見分光光度計測定吸光度值，計算得到RSD為1.4%，說明該方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 精密移取6份1 mL供試溶液置于25 mL量瓶中，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的0.200 mg/mL上述對照品溶液，分別相當于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg，定容，搖勻，在268 nm波長處測定吸光度，計算得平均回收率為99.2%，RSD為0.57%。

2.1.8 大蝎子草中總黃酮的定量測定 取大蝎子草提取液適量，過濾，3 000 r/min離心10min，精密移取上清液5mL，備用；分別采用石油醚洗脫、乙酸乙酯萃取等多種樣品處理方法進行考察，最后采用精密移取離心后的大蝎子草提取液5 mL，置于蒸發(fā)皿中，揮干，60%乙醇洗至25 mL量瓶中，定容；再精密移取1 mL置25 mL量瓶中，95%乙醇定容，于波長268 nm處測定吸光度值并計算總黃酮的含有量。

2.2 大蝎子草總黃酮閃式提取［8-9］

2.2.1 因素水平 選取蒸餾水溫度 （℃），料液比（m/V），提取時間（min）為考察因素，見表1。

表1 閃式提取工藝因素水平

2.2.2 實驗方法 分別稱取大蝎子草細粉9份，每份20 g，閃提轉(zhuǎn)速4 000 r/min，電壓200 V，按L9（34）正交試驗表進行試驗設計，見表2，測定提取液中總黃酮含有量，考察最佳提取工藝條件。

表2 閃式提取工藝正交試驗安排及結(jié)果

2.2.3 方差分析 運用SPSS軟件對正交試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析

由表3可知，A、B因素對閃式提取大蝎子草總黃酮含有量的影響具有統(tǒng)計學意義，結(jié)合直觀分析，各因素影響大小順序為：B＞A＞C，即料液比＞蒸餾水溫度＞提取時間，最佳工藝條件是A2B3C2，即蒸餾水溫度60℃，料液比為1∶75，提取時間為4 min。

2.2.4 最佳提取工藝驗證試驗 稱取大蝎子草細粉5份，每份20 g，按照最佳工藝進行提取，測定并計算總黃酮含有量，得到總黃酮平均含有量為9.093 mg/g生藥，RSD為1.7%，見表4。

表4 最佳提取工藝的驗證試驗

3 討論

閃式提取器外刀腔內(nèi)高速旋轉(zhuǎn)，內(nèi)外刀之間不僅產(chǎn)生強大的剪切作用，同時外刀腔內(nèi)產(chǎn)生強大的負壓，藥材被破碎而充分暴露的物質(zhì)分子 （被提取成分）在負壓、剪切、高速碰撞等各種外力作用下被溶劑分子包圍，解離，溶解，替代，脫離，然后迅速進入溶劑中，瞬間達到溶劑濃度的平衡，在數(shù)秒內(nèi)快速完成提取過程［10］。

本次閃式提取研究中，首先根據(jù)黃酮的理化性質(zhì)，設置50倍溶劑量，采用單因素試驗進行50%、60%、70%乙醇提取大蝎子草總黃酮閃式提取考察，結(jié)果顯示，總黃酮最大提取率僅為3.45mg/g，低于前期水為溶劑回流提取正交試驗考察結(jié)果。結(jié)合前期總黃酮測定方法，采用較優(yōu)的工藝條件，用水和乙醇為溶劑進行了回流提取的比較，結(jié)果顯示，對于大蝎子草總黃酮的提取，水為溶劑比乙醇作為溶劑的效果好，所以閃式提取工藝考察中采用水為溶劑進行，同時還進行了蒸餾水不同溫度的考察，結(jié)果表明，當蒸餾水溫度為60℃時提取率比40℃和80℃好，40℃時優(yōu)于80℃，原因可能是，黃酮類化合物一般都以苷的形式存在，苷易溶于熱水，所以熱水效果優(yōu)于冷水；但由于80℃的溫度過高，使藥材細胞表面蛋白迅速固化成膜，外界的水不易進入細胞，細胞不能因滲透壓差破裂，及細胞內(nèi)物質(zhì)擴散效率變低，總黃酮不能從細胞內(nèi)高效提取出來。

本實驗以總黃酮提取率為指標，以蒸餾水溫度、料液比、提取時間作為正交試驗的3個考察因素，并各設了3個水平對大蝎子草的閃式提取工藝進行了考察。由實驗結(jié)果可知，閃式提取大蝎子草總黃酮的最大影響因素是料液比，其次是蒸餾水溫度，最小影響因素是提取時間。結(jié)合直觀分析，可以確定最佳實驗條件是A2B3C2，即提取溫度為60℃，料液比為1∶75，提取時間為4min，按該最佳提取工藝進行提取時，大蝎子草總黃酮為9.093 mg/g生藥。

閃式提取法具有快速高效、省時、操作簡便等優(yōu)點，能最大限度保護植物的有效成分不受熱破壞，提取率高，節(jié)約能源［11］。但由于大蝎子草藥材質(zhì)地疏松，回流提取至少都需要接近20倍的溶劑量，采用閃式提取所用溶劑量更是大為提高。

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：1001-1528（2015）07-1603-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.049

2014-08-03

貴州省科技廳國際合作項目 （黔科合外G字 ［2012］7041）；貴州省中醫(yī)藥管理局課題項目 （QZYY2012-46）；貴州省中醫(yī)藥管理局課題項目 （QZYY2019-92）；貴陽市科技局現(xiàn)代藥業(yè)計劃項目 （2012204）；貴陽市科技局大學生創(chuàng)新課題 （黔科合同2012［2］）

李桂蘭 （1965—），女，實驗師，研究方向為中藥民族藥新藥研發(fā)。Tel：（0851）6908568，E-mail：1254679469@qq.com

*通信作者：陶 玲 （1975—），女，教授，碩士生導師。Tel：（0851）6908568（721），E-mail：649511230@qq.com沈祥春（1973—），男，博士，教授，博士生導師。Tel：（0851）6908568，E-mail：shenxiangchun@126.com