柿葉乙酸乙酯部位急性毒性及其對S180荷瘤小鼠的影響

陳 麗， 羅 宇， 梁宇紅， 馬新博， 韋 敏， 陳 君*

（1.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西柳州545005；2.柳州市工人醫(yī)院，廣西柳州545005；3.柳州市人民醫(yī)院，廣西柳州545006）

柿葉乙酸乙酯部位急性毒性及其對S180荷瘤小鼠的影響

陳 麗1， 羅 宇1， 梁宇紅2， 馬新博1， 韋 敏3， 陳 君1*

（1.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西柳州545005；2.柳州市工人醫(yī)院，廣西柳州545005；3.柳州市人民醫(yī)院，廣西柳州545006）

目的研究柿葉乙酸乙酯部位對正常小鼠急性毒性試驗(yàn)和對S180荷瘤小鼠的影響。方法在急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立S180荷瘤小鼠模型。將荷瘤小鼠隨機(jī)分為柿葉乙酸乙酯部位高、中、低劑量組，模型組和環(huán)磷酰胺組。給藥10 d后觀察小鼠的腫瘤生長情況，計(jì)算抑瘤率、生命延長率、胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)、肝臟系數(shù)，瘤組織做病理切片。結(jié)果小鼠一次灌胃柿葉乙酸乙酯部位最大給藥量不小于生藥589.82 g/kg。環(huán)磷酰胺及柿葉乙酸乙酯部位高、中、低劑量對S180荷瘤小鼠抑瘤率分別為73.47%、37.91%、27.22%、11.02%。生命延長率分別為54.91%、36.99%、22.54%、8.09%。柿葉乙酸乙酯部位高、中、低劑量組的胸腺系數(shù) ［（2.91±0.38）mg/g、（2.82±0.31）mg/g、（2.64±0.20）mg/g］和脾臟系數(shù)［（8.49±0.36）mg/g、（8.11±0.48）mg/g、（8.03±0.42）mg/g］均明顯比模型組［（2.20±0.36）mg/g、（7.42±0.92）mg/g］和環(huán)磷酰胺組［（1.94±0.24）mg/g、（6.81±0.52）mg/g］高 （P＜0.01）。柿葉乙酸乙酯部位高、中、低劑量組的肝臟系數(shù) ［（49.24±6.33）mg/g、（51.17±4.88）mg/g、（55.59±8.74）mg/g］比模型組（62.19±8.10）mg/g和環(huán)磷酰胺組（69.19±9.50）mg/g低（P＜0.01或P＜0.05）。用藥組腫瘤組織HE染色后，均可見不同程度的壞死灶，其中柿葉乙酸乙酯部位高劑量組壞死面積最大。結(jié)論柿葉乙酸乙酯部位毒性低，能抑制S180荷瘤小鼠腫瘤增殖。

柿葉；乙酸乙酯部位；肉瘤S180小鼠；抗腫瘤作用；急性毒性

柿葉為柿樹科Ebenaceae柿樹屬Diospyros植物柿Diospyros kaki L.f.的新鮮或干燥葉。柿葉具有抗菌消炎、生津止渴、清熱解毒、潤肺強(qiáng)心、鎮(zhèn)咳止血、抗癌防癌等多種醫(yī)療保健功能。已有報(bào)道，柿葉水、醇提取物作用于體外H22細(xì)胞和H22、S180荷瘤小鼠，有明顯的抑瘤效應(yīng)［1-3］；柿葉黃酮能明顯抑制由TNF-α誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1蛋白的表達(dá)［4］，并對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的形態(tài)有一定的誘變作用及一定的抑制增殖作用［5］。柿葉主要有效成分黃酮類化合物存在于其乙酸乙酯部位，故本研究以S180荷瘤小鼠為研究對象，對柿葉乙酸乙酯部位體內(nèi)抗腫瘤作用進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用柿葉提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 柿葉 （購自廣西柳州市城站藥材綜合市場，經(jīng)中國科學(xué)院廣西植物研究所韋發(fā)南研究員鑒定為真品）；柿葉乙酸乙酯部位由實(shí)驗(yàn)室自行制備：柿葉粗粉500 g用70%乙醇回流提取2次，合并濾液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后用乙酸乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮干燥，研碎得乙酸乙酯萃取部位13.75 g，用時以吐溫80為增溶劑，加蒸餾水適量即得不同質(zhì)量濃度的受試物，現(xiàn)用現(xiàn)配；空白溶劑：由0.5 mL吐溫80與50 mL蒸餾水混勻即得；環(huán)磷酰胺（陜西普德藥業(yè)股份有限公司，批號：04120703）。

1.2 儀器 RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器 （上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；BSC-1300ⅡA2生物安全柜 （上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；TS-12F生物組織自動脫水機(jī) （孝感市電子儀器廠）；NP-B型生物組織包埋機(jī) （孝感市諾普電子科技有限公司）；RM2235組織切片機(jī) （德國徠卡）；NP-P型生物組織攤片烤片機(jī) （孝感市諾普電子科技有限公司）；BX-53顯微鏡（日本Olympus公司）；SB-3200DTDN超聲波清洗機(jī) （寧波新芝生物科技股份有限公司）；移液器 （賽默飛世爾儀器有限公司）。

1.3 動物 健康昆明種小鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供 （許可證號：SCXK桂2009-0002）；S180肉瘤荷瘤小鼠購自廣西中醫(yī)藥研究院。

2 方法

2.1 急性毒性試驗(yàn)［6］健康昆明小鼠20只，雌雄各半，隨機(jī)分成對照組和給藥組，每組10只，試驗(yàn)前禁食不禁水12 h。對照組給予空白溶劑。給藥組給予柿葉乙酸乙酯部位，以吐溫80為增溶劑，加適量蒸餾水研磨均勻，配制成剛好能通過16號灌胃針的混懸液，按小鼠灌胃最大容積一次給藥（灌胃容積為0.4 mL/10 g），即16.22 g/kg，相當(dāng)于生藥589.82 g/kg。給藥后立即觀察小鼠的反應(yīng)，包括行為活動、大小便、體質(zhì)量及死亡情況，連續(xù)觀察14 d。試驗(yàn)結(jié)束第15天頸椎脫臼處死小鼠，解剖觀察其心、肝、脾、胃、腎等主要器官的變化。

2.2 柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠的影響 S180腹水小鼠連續(xù)傳代，將接種第7天腹水飽滿的S180荷瘤小鼠以頸椎脫臼法處死，無菌條件下抽取其乳白色腹水，加入生理鹽水使瘤細(xì)胞稀釋至1×107個/m L，然后于小鼠右前肢腋窩皮下注射0.2mL/只，接種100只。接種次日，隨機(jī)將小鼠分為5組，每組20只，雌雄各半，分別為：模型組、環(huán)磷酰胺組、柿葉乙酸乙酯部位高、中、低劑量組。接種次日給藥，各組用藥情況為：模型組灌胃空白溶劑20mL/kg；環(huán)磷酰胺組灌胃環(huán)磷酰胺100mg/kg；柿葉乙酸乙酯部位按2、1、0.5 g/kg劑量以等體積（0.2 mL）不同濃度灌胃（分別相當(dāng)于生藥72.73 g/kg、36.36 g/kg、18.18 g/kg）；各組每天用藥1次，連續(xù)10 d，實(shí)驗(yàn)期間每天定量喂飼，次日稱取剩余飼料，計(jì)算小鼠每日攝食量，實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱量小鼠體質(zhì)量。第11天各組以頸椎脫臼法隨機(jī)處死10只小鼠，雌雄各半，剩余小鼠亦停藥并記錄存活天數(shù)用以計(jì)算生命延長率，存活天數(shù)超過30 d的按30 d計(jì)［7］。處死的小鼠小心剝離瘤組織、胸腺、肝臟、脾臟，稱重，并計(jì)算抑瘤率、胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)和肝臟系數(shù)。將剝離的腫瘤組織HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察腫瘤組織病理變化并采集圖片。各計(jì)算公式為：

表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 急性毒性試驗(yàn) 按小鼠灌胃最大容積給藥后，部分小鼠有惡心、少動現(xiàn)象，約0.5 h后恢復(fù)正常。連續(xù)觀察14 d，對照組和給藥組小鼠行為活動、大小便都正常，無小鼠死亡。每7天稱一次體質(zhì)量，體質(zhì)量均正常增加，兩組無顯著性差異，結(jié)果見表1。第15天處死給藥組小鼠后取其心、肝、脾、胃、腎用肉眼與對照組進(jìn)行比較，未見組織有異常改變。因此，可認(rèn)為柿葉乙酸乙酯部位毒性低，小鼠一次灌胃柿葉乙酸乙酯部位的最大給藥量不小于生藥589.82 g/kg。

表1 柿葉乙酸乙酯部位對正常小鼠體質(zhì)量的影響 （n= 10，x±s）

3.2 柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠體質(zhì)量和攝食量的影響 從表2可見，給藥期間，環(huán)磷酰胺組小鼠平均攝食量明顯比其他組少，柿葉乙酸乙酯部位各劑量組攝食量明顯高于環(huán)磷酰胺組和模型組 （P＜0.05或P＜0.01）；給藥前各組小鼠體質(zhì)量無顯著性差異，給藥10 d后柿葉乙酸乙酯部位各劑量組小鼠體質(zhì)量均比模型組和環(huán)磷酰胺組顯著增加 （P＜0.01），模型組與環(huán)磷酰胺組的體質(zhì)量無顯著性差異。

表2 給藥期間S180荷瘤小鼠的攝食量和體質(zhì)量的影響 （x±s，n=20）

3.3 柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠瘤質(zhì)量、抑瘤率、胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)和肝臟系數(shù)的影響 從表3可見，柿葉乙酸乙酯部位各劑量組均有不同程度的抑瘤效果，其中乙酸乙酯高劑量組效果更為明顯，但低劑量組的瘤質(zhì)量和模型組無顯著性差異 （P＞0.05），從數(shù)據(jù)上看，柿葉乙酸乙酯部位對S180小鼠的抑瘤率與劑量具有一定的正相關(guān)性；柿葉乙酸乙酯高、中、低劑量組胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)、肝臟系數(shù)與環(huán)磷酰胺組相比較，區(qū)別明顯 （P＜0.05或P＜0.01），但與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），說明環(huán)磷酰胺對胸腺、脾臟、肝臟的毒副作用明顯，而柿葉乙酸乙酯部位對以上臟器無損害。

表3 柿葉乙酸乙酯部位對S180小鼠抑瘤率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)的影響 （x±s，n=10）

3.4 柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠生命延長率的影響

柿葉乙酸乙酯高、中、低劑量組的荷瘤小鼠生存天數(shù)與模型組比較明顯延長 （P＜0.01），柿葉乙酸乙酯低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），柿葉乙酸乙酯部位對S180小鼠的生命延長率與劑量有一定的正相關(guān)，結(jié)果見表4。

表4 柿葉乙酸乙酯部位對 S180小鼠生命延長率的影響（x±s，n=10）

3.5 腫瘤組織病理學(xué)觀察 HE染色可見模型組腫瘤組織排列不規(guī)則，腫瘤細(xì)胞較大，核漿比例大，異型性明顯，可觀察到巨核、雙核、奇異核等腫瘤細(xì)胞，病理性核分裂象較多；環(huán)磷酰胺組亦可見少量模型組腫瘤細(xì)胞的形態(tài)特征，有少量纖維化組織形成，腫瘤組織中可見大片壞死灶，病理性核分裂象很少；柿葉乙酸乙酯部位各劑量組中，高劑量組腫瘤組織中可見明顯片狀的凝固性壞死，壞死面積明顯比中、低劑量組大，可呈一定量效關(guān)系，瘤細(xì)胞核固縮，大小較為一致，異型性小，壞死主要位于排列松散的細(xì)胞間，病理性核分裂象比模型組明顯減少。見圖1。

4 討論

陳壁峰等［8］將柿葉乙醇提取物用于大鼠，發(fā)現(xiàn)有亞慢性毒性和致畸作用；吳睿等［9］對柿葉提取物進(jìn)行急性毒性及其遺傳毒性研究，結(jié)果未見明顯毒性。由柿葉乙酸乙酯部位開發(fā)而成的 “腦心清片”等中成藥已應(yīng)用于臨床多年［10］，但柿葉乙酸乙酯部位的急性毒性卻鮮有報(bào)道。本研究采用經(jīng)典的最大給藥量試驗(yàn)對柿葉乙酸乙酯部位進(jìn)行急毒試驗(yàn)，給藥后觀察14 d，結(jié)果無動物死亡，未能測定出LD50，小鼠體質(zhì)量均正常增加，與對照組無顯著差異；試驗(yàn)結(jié)束時觀其心、肝、脾、胃、腎，未見病理改變。故可認(rèn)為柿葉乙酸乙酯部位毒性低，小鼠一次灌胃柿葉乙酸乙酯部位的最大給藥量不小于生藥589.82 g/kg，驗(yàn)證了前述報(bào)道。

圖1 給藥10 d后各組小鼠腫瘤組織病理切片 （×200）

通過提高機(jī)體的免疫功能而控制腫瘤的生長、發(fā)展已漸漸成為惡性腫瘤治療的手段之一，中藥對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和扶正抗癌作用已越來越受到人們的重視［11］。環(huán)磷酰胺雖有很高的抑瘤作用 （抑瘤率高達(dá)73.47%），但其所導(dǎo)致的食欲降低［12］及對免疫器官、代謝器官的影響在不少文獻(xiàn)中有報(bào)道［13-14］，本研究亦驗(yàn)證了環(huán)磷酰胺在這方面的毒副作用。實(shí)驗(yàn)中荷瘤小鼠應(yīng)用環(huán)磷酰胺后平均攝食量減少，體質(zhì)量增加不多，并且胸腺和脾臟的質(zhì)量減少，肝臟質(zhì)量增加，說明環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致小鼠食欲下降，減少S180荷瘤小鼠免疫器官胸腺和脾臟的質(zhì)量，增加代謝器官肝臟的質(zhì)量，對免疫器官和代謝器官有一定的毒性。柿葉乙酸乙酯部位不影響小鼠的攝食量和體質(zhì)量，并能增加S180荷瘤小鼠胸腺和脾臟的質(zhì)量，減少代謝器官肝臟的質(zhì)量，從而提高胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)，降低肝臟系數(shù)，說明柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠的免疫和代謝器官具有一定的保護(hù)作用，但其對S180荷瘤小鼠的免疫效應(yīng)需做進(jìn)一步研究。另外，環(huán)磷酰胺需臨用臨配，因?yàn)樵撍幣涑扇芤汉蟛环€(wěn)定，應(yīng)于2～3 h內(nèi)輸入體內(nèi)。

生命延長率和抑瘤率是抗腫瘤藥物在藥效學(xué)研究方面的重要和基礎(chǔ)性指標(biāo)，一種藥物是否能夠抗腫瘤首先表現(xiàn)在這兩個方面［15］。本研究表明柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠最長生命延長率為36.99%，可明顯延長荷瘤小鼠的生存時間；柿葉乙酸乙酯部位能顯著減少S180荷瘤小鼠的瘤質(zhì)量，提高抑瘤率，最大抑瘤率為37.91%。以上研究結(jié)果說明柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠具有明顯的抗腫瘤作用，并且該部位對S180荷瘤小鼠的生命延長率和抑瘤率與劑量具有一定的正相關(guān)性，其量效關(guān)系及進(jìn)一步的機(jī)制有待深入研究。

腫瘤組織病理學(xué)切片可見，模型組腫瘤組織內(nèi)壞死細(xì)胞較少，腫瘤細(xì)胞排列紊亂，核染色深，異形核細(xì)胞多見。用藥后腫瘤組織內(nèi)可見大面積壞死細(xì)胞，可見纖維化的形成。這從微觀病理學(xué)角度說明柿葉乙酸乙酯部位能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡，抑制S180荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞的生長。柿葉乙酸乙酯部位是否確實(shí)能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞早期凋亡，需對瘤組織進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）06-1339-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.041

2014-03-12

廣西醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心開放基金專項(xiàng)項(xiàng)目 （KFJJ2011-17）

陳 麗（1977—），女，碩士，副教授，研究方向?yàn)樯幚韺W(xué)及中藥新劑型。E-mail：chenlilzyz@163.com。

*通信作者：陳 君，女，碩士，副教授，研究方向?yàn)橹兴?、民族藥有效成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。