RP-HPLC法測定川楝子提取物中川楝素的含量

楊 歡，趙學偉，胡 楠

（1.承德醫(yī)學院中藥學系2012級本科，河北承德 067000;2.指導教師）

（學生園地欄目編輯:張 ?。?/p>

川楝子，別稱金鈴子，為楝科植物川楝(Melia toosendan Sied.Et Zucc)的果實。川楝子以“楝實”之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。川楝子性苦寒，有小毒，具有舒肝、行氣止痛、驅(qū)蟲等作用，用于胸脅、脘腹脹痛、疝痛、蟲積腹痛等病癥的臨床治療[1]。川楝素(Toosendanin,C30H38O11)為川楝子中已明確的化學成分，也是起到藥理作用的主要成分，是一種四環(huán)三萜化合物[2]。本研究采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC）測定川楝子藥材提取物中川楝素的含量，方法簡便、快速、穩(wěn)定性好，為川楝素的定量分析提供了參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 1515-717i-2487液相系統(tǒng)，美國Waters公司;Empower 2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Waters公司;BP211D(Max 210g,d=0.01mg)電子分析天平，德國Sartorius公司;KQ-100型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑 甲醇(HPLC級)，美國Fisher公司;乙腈(HPLC級)，美國Fisher公司;川楝子，購自亳州醫(yī)藥公司(經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所何希榮老師鑒定為正品）;川楝素對照品(批號130621），成都普菲德生物技術有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 川楝子提取物的制備 取川楝子藥材，粉碎，加入8倍量60%的乙醇，加熱回流提取2h，共提取3次。提取液趁熱過180目篩，減壓回收乙醇，真空干燥，干燥物粉碎成細粉，過80項目篩，得到川楝子提取物。

2.2 供試品溶液的制備 稱取2.1項中得到的川楝子提取物0.25g，置三角燒瓶中，加入10ml甲醇，稱重，超聲提取1h。室溫放冷，再稱重，甲醇補重，搖勻，過0.22μm微孔濾膜過濾后備用。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取川楝素對照品95mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到濃度為95μg/ml的川楝素對照品溶液，備用。

2.4 色譜條件 Ultra ll C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動相:乙腈:水(35:65);流速：1.0ml/min;檢測波:215nm;柱溫:30℃。上述色譜條件下得到對照品和提取物的色譜圖見附圖:

附圖 川楝素對照品(A)和提取物(B）色譜圖

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察:精密吸取濃度為95μg/ml的對照品溶液2,4,6,8,10,15μl,注入液相色譜儀，按照2.4項的色譜條件進行分析。以進樣量(X)對色譜峰面積(Y)進行線性回歸處理，得回歸方程:Y=309.87X+9.5109,r=0.9993。結(jié)果表明，川楝素在0.192-1.44μg范圍內(nèi)呈良好線性關系。

2.5.2 精密度試驗:精密稱取川楝子提取物粉末0.25g，按2.2項的方法制備供試品溶液，按照2.4項的色譜條件重復進樣5次，得到川楝素色譜峰面積，RSD為1.1%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗:精密稱取川楝子提取物粉末0.25g，共5份，按2.2項的方法制備供試品溶液，分別取5μl注入液相色譜儀，按照2.4項的色譜條件進行分析測定，得到川楝素色譜峰面積，RSD為2.3%(n=5)，表明本方法重復性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗:精密稱取已知川楝素含量的川楝子提取物粉末適量，共5份，分別精密加入一定量的川楝素對照品，按2.2的方法制備供試品溶液，測定并計算加樣回收率。平均加樣回收率為99.1%，RSD為1.5%（n=5），表明本方法準確度良好。結(jié)果見附表。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗:精密稱取川楝子提取物粉末0.25g，按2.2項的方法制備供試品溶液，按照2.4項的色譜條件，分別在0、4、8、12、24h 進樣5μl，得到川楝素色譜峰面積的RSD為2.1%(n=5)。結(jié)果表明，川楝素在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

附表 加樣回收率試驗結(jié)果

2.5.6 樣品含量測定:按2.2項的方法制備川楝子提取物供試樣品溶液3份，按照2.4項的色譜條件進樣10μl測定，根據(jù)標準曲線方程計算川楝素的含量，樣品1、2、3中川楝素的含量分別為3.55mg/g、3.44mg/g和3.34mg/g。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取川楝素對照品，進行紫外全波長掃描，得到川楝素最大吸收波長為208.2nm，但在此波長處存在末端吸收。為了消除背景，提高信噪比，得到良好峰形，本實驗對不同波長處的色譜峰進行比較，最終確立川楝素的檢測波長為215nm。

3.2 提取工藝 川楝子藥材中川楝素含量很低，為保證藥材中川楝素含量測定的準確性，在之前的實驗中，采用L9(34)正交設計表，考察了乙醇濃度、回流時間及提取次數(shù)對川楝素提取率的影響，最終確立了2.1項中川楝子提取物的制備方法。

3.3 含量測定 在2010版中華人民共和國藥典中依然未給出川楝素含量測定的方法。現(xiàn)存文獻中，川楝素的含量測定包括薄層色譜法[3]、HPLC法[4]、液質(zhì)聯(lián)用法(LCMS)[5]等。本實驗建立了RP-HPLC法測定川楝子提取物中川楝素含量的方法，可以較好地將川楝素的色譜峰與雜質(zhì)峰分離，能反映樣品的真實性，方法簡便、準確、靈敏，為川楝素的定量分析提供了參考。在含量計算的過程中，由于川楝素化學結(jié)構(gòu)中存在醛-酮式結(jié)構(gòu)的互變，表現(xiàn)在色譜圖中為雙峰，因此將峰面積帶入2.5.1項中得到的線性方程進行含量計算時，川楝素色譜峰峰面積為得到的川楝素兩個同分異構(gòu)體色譜峰峰面積之和。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中國藥典一部(2010年版)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.39.

[2] 舒國慶，梁曉天.關于川楝素化學結(jié)構(gòu)的修正[J].化學學報，1980，38(2):196-198.

[3] 吳安安，張弦，潘揚.苦楝皮苦楝果中苦楝素含量的薄層-比色法測定研究[J].中醫(yī)藥學刊，2003,21(1):159-160.

[4] 王旭，楊建云，肖炳坤，等.RP-HPLC法測定川楝子水提醇沉提取物中川楝素的含量[J].科學技術與工程，2013,13(16):4631-4634.

[5] Ong ES,Ong CN.Qualitative and quantitative analysis of toosendan in Melia toosendan Sieb.Et Zucc (Meliaceae) with liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2007,21(4):589-598.