不同產地赤雹根中總皂苷含量的比較分析*

劉春楠，洪文婷，祝晴晴，佟繼銘，劉永平

（承德醫(yī)學院中藥研究與開發(fā)重點實驗室/承德醫(yī)學院中藥研究所，河北承德 067000）

赤雹根是葫蘆科赤雹屬多年蔓生草本植物赤雹的干燥成熟塊根，主要生長于華北、東北、內蒙等地區(qū)，性寒味苦，具有活血祛瘀、清熱解毒、通乳等功效，為滿族民間常用藥，主要用于治療風濕痹痛、腰腿痛、痛經以及軟組織損傷等[1]。赤雹根主要有效部位之一為赤雹根總皂苷，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，赤雹根總皂苷具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用[2-4]。本研究以齊墩果酸為對照品，采用紫外-可見分光光度法測定不同產地赤雹根中總皂苷的含量，以期為選擇赤雹根種植地域及其臨床應用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

旋轉蒸發(fā)儀(EYELA，上海愛朗儀器有限公司）;紫外-可見分光光度計(HP-8453，惠普）;電熱套(ZDHW-1000，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）;分析天平(梅特勒-托利多AG245）;電熱恒溫水浴鍋(上海東星建材試驗設備有限公司）;大孔吸附樹脂柱(北京博美玻璃有限公司）。

赤雹根藥材于2013年10月分別采集于東北吉林(栽培品）、河北承德(栽培品）、河北青龍(野生），經承德醫(yī)學院中藥研究所佟繼銘教授鑒定為正品赤雹根。AB-8大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；齊墩果酸標準品(批號:110709-201206，中國藥品生物制品檢定所）。

2 方法與結果

2.1 赤雹根總皂苷的制備 分別取三個不同產地的赤雹根飲片各30g，置于500ml圓底燒瓶中加入240ml 70%乙醇浸泡過夜，80℃回流提取三次，每次1h。合并三次提取液、抽濾，將濾液置于1000ml圓底燒瓶中減壓濃縮，將濃縮液于烘箱中80℃烘干。用30ml水將上述所得干膏溶解(生藥濃度1g/ml)，過AB-8大孔吸附樹脂柱，并依次用4倍量純水、70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮，將濃縮液于烘箱中80℃烘干，即得赤雹根總皂苷。

2.2 供試品溶液和標準曲線的制備

2.2.1 對照品溶液的制備:精密稱定齊墩果酸標準品10mg，用甲醇溶解并定容至10ml，精密量取上述標準液1ml于10ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得濃度為0.1mg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備:取2.1制備的赤雹根(河北青龍）總皂苷10mg，精密稱定，用甲醇超聲溶解并定容至10ml，搖勻，即得。

2.2.3 測定方法:采用紫外可見光分光光度法檢測赤雹根總皂苷的含量。精密吸取對照品溶液和供試品溶液各1ml于10ml具塞比色管中，80℃水浴揮干，分別加入0.2ml 5%香草醛-冰醋酸溶液，混勻，然后分別加入0.8ml高氯酸，混勻后60℃水浴30min，流水冷卻5min，再分別加入5ml冰醋酸，搖勻，靜置10min。于波長545nm處分別測定供試品溶液與對照品溶液的吸光度。

2.2.4 標準曲線的制備:精密吸取0.1mg/ml的對照品溶液300、450、600、750、900μl，置10ml具塞比色管中。按

2.2.3 的方法進行測定，以吸光度(A）值為縱坐標，齊墩果酸的濃度(μg/ml）為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程:A=0.0559C-0.0271，r=0.9997。表明赤雹根總皂苷在13.13-39.41μg/ml范圍內呈良好的線性關系。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗:精密吸取6份0.1mg/ml的對照品溶液各800μl，置10ml具塞EP管中。按2.2.3的方法測定吸光度。結果吸光度平均值為0.42347，RSD值為0.67%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗:精密吸取供試品溶液1ml，置10ml具塞EP管中。按2.2.3的方法進行測定，每10min測定一次，連續(xù)測定10次。所測得吸光度的平均值為0.58472，RSD值為2.91%，表明供試品溶液在1.5h內穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗:精密吸取6份供試品溶液各1ml，置10ml具塞EP管中。按2.2.3的方法測定吸光度。所測得吸光度的平均值為0.63733，RSD值為2.78%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗:精密吸取6份供試品溶液各1ml，置10ml具塞EP管中，依次加入200μl 0.1mg/ml的對照品溶液。按2.2.3的方法依次測定吸光度，并計算加樣回收率，結果見表1。

2.4 含量測定 分別精密稱定2.1中三個不同產地的赤雹根總皂苷各10mg，用甲醇超聲溶解并定容至10ml，各精密吸取1ml于10ml具塞EP管中，按2.2.3的方法測定吸光度，并計算赤雹根總皂苷的含量，結果見表2。

表1 赤雹根總皂苷加樣回收率測定結果

表2 三個不同產地赤雹根大孔樹脂純化后總皂苷和赤雹根藥材中總皂苷的含量(%)

3 討論

本研究采用紫外-可見分光光度法測定了赤雹根中三萜類總皂苷的含量，該方法操作簡便，重復性良好，可用于赤雹根總皂苷的含量測定。在顯色的過程中，分別考察了濃硫酸、1%對二氨基苯甲醛、5%香草醛-冰醋酸-高氯酸、2%香草醛-硫酸等顯色劑進行顯色，由于5%香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色效果較好，故以5%香草醛-冰醋酸-高氯酸作為總皂苷顯色劑。同時，本研究對顯色時間進行了考察，發(fā)現(xiàn)60℃水浴30min顯色效果最佳，故顯色時間定為30min。由于市面上無赤雹根皂苷類標準品，故本研究采用齊墩果酸為標準品測定赤雹根中總皂苷的含量，經過預實驗確定檢測波長定為545nm。

結果顯示，本研究中人工栽培的赤雹根藥材中赤雹根總皂苷的含量以河北承德為最高，含量為0.38%，遠高于東北吉林栽培的赤雹根總皂苷的含量（0.12%），但明顯低于河北青龍采收的野生赤雹根藥材中的赤雹根總皂苷含量（0.59%）。赤雹根藥材的人工栽培基地的選擇以河北承德相對較好，種植模式和生長環(huán)境對赤雹根中總皂苷含量的影響有待進一步深入研究。

[1] 宋立人,紅恂 ,丁緒亮 ,等 .現(xiàn)代中藥大辭典 (上冊 )[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2001.1022.

[2] 張玉玲,趙波,陳建雙,等.赤雹根鎮(zhèn)痛作用及有效部位研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(10):2483-2484.

[3] 陳建雙，張玉玲，趙波，等.赤雹根總皂苷抗炎作用研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(8)：163-166.

[4] 劉永平，陳建雙，趙波，等.赤雹根總皂苷對實驗性佐劑型關節(jié)炎鎮(zhèn)痛作用的研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(8):1659-1661.