制川烏配伍白芍對6 種烏頭生物堿經(jīng)皮吸收的影響

楊華生， 梁秉文， 黎曉麗， 羅永明， 吳 璐*

(1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330004;2. 中國人民解放軍第454 醫(yī)院，江蘇 南京210002)

制川烏為毛茛科植物烏頭Aconitum carmchaeli Dex. 的母根的炮制加工品，味辛、苦，性熱，有毒，主要含有雙酯型烏頭生物堿烏頭堿(aconitine，AT)、次烏頭堿(hypaconitine，HT)、新烏頭堿(meaconitine，MT)及毒性較低的單酯型生物堿苯甲酰烏頭原堿(benzoylaconine，BA)、苯甲酰次烏頭原堿(benzoylhypaconine，BH)、苯甲酰新烏頭原堿(benzoylmesaconine，BM)，以及毒性更低的脂型生物堿等［1］;白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloria pall. 的干燥根，主要含有芍藥苷、芍藥花苷等。制川烏與白芍常配伍使用，《中醫(yī)方劑大辭典》記載有制川烏-白芍配伍的方劑就達(dá)208 首之多［2］，為歷代醫(yī)家廣為重用的藥對，代表方劑有烏頭湯，主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰椎間盤突出癥、坐骨神經(jīng)痛、膝關(guān)節(jié)積液等。

目前，制川烏白芍配伍機(jī)理的研究主要從體外、體內(nèi)兩個方面進(jìn)行，體外從化學(xué)成分溶出量探討“增效減毒”的物質(zhì)基礎(chǔ)，體內(nèi)多采用口服等非外用給藥途徑研究配伍對藥效的影響［3］。臨床已證實(shí)，經(jīng)皮給藥等“中醫(yī)外治”法是治療疼痛、炎癥等風(fēng)濕痹證最常用、最有效的給藥方式之一，制川烏白芍配伍經(jīng)皮給藥后，是否也可產(chǎn)生“增效減毒”效應(yīng)，其機(jī)理如何，目前還沒有針對這些問題的研究。本實(shí)驗(yàn)從經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)的角度探討制川烏白芍配伍“增效減毒”的配伍機(jī)理，從現(xiàn)代經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)角度探討并詮釋傳統(tǒng)外用中藥配伍的合理性。

1 材料與儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀，Agilent 化學(xué)工作站(美國Agilent 公司);YB-P6 智能透皮試驗(yàn)儀(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠);賽多利斯BS 110S 型電子分析天平(北京賽多利斯公司)。

制川烏飲片購自江油恒源藥業(yè)集團(tuán)有限公司，產(chǎn)地四川;白芍飲片購自亳州市長生中藥飲片有限公司，產(chǎn)地安徽，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)付小梅副教授鑒定分別為毛茛科植物烏頭Aconitum carmchaeli Dex. 母根的炮制加工品和毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall 的干燥根。白芍提取物(取白芍飲片，加70%乙醇回流提取，合并濾液，揮干乙醇，濃縮，D101 大孔樹脂純化，收集70% 乙醇洗脫液，揮干乙醇，真空干燥得白芍干浸膏，以芍藥苷計(jì)263.49 mg/g，以芍藥總苷計(jì)506.7 mg/g);制川烏提取物(取制川烏粗粉，加95%乙醇冷浸3次，分別提取5、3、2 d，合并濾液，常溫下?lián)]干乙醇，加水稀釋到每3 mL 提取液中含有1 g 生藥，D101 大孔樹脂純化，收集無水乙醇洗脫液，常溫下?lián)]干乙醇，真空干燥，得制川烏干浸膏［4-6］，其中以單酯型生物堿計(jì)為30.43 mg/g，以雙酯型烏頭生物堿計(jì)為9.39 mg/g );苯甲酰新烏頭原堿(批號111795-201102)、苯甲酰烏頭原堿 (批號111794-201102)、苯甲酰次烏頭原堿 (批號111796-201002)、 新 烏 頭 堿 (批 號 110799-201106)、次烏頭堿(批號110798-201307)、烏頭堿(批號101720-201111)、芍藥苷(批號110736-201337，純度94.9%)，購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為雙蒸水;其他試劑均為分析純。

昆明種清潔級小鼠，體質(zhì)量18 ～22 g，由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號SCXK(贛)2011-0001。

2 方法

2.1 接收液中6 種酯型烏頭生物堿的測定

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照品適量，加0.01 mol/L 的鹽酸制成質(zhì)量濃度分別為苯甲酰新烏頭原堿165.6 μg/mL、苯甲酰烏頭原堿25.4 μg/mL、苯甲酰次烏頭原堿24.6 μg/mL、新烏頭堿67.2 μg/mL、次烏頭堿 75.6 μg/mL、烏頭堿 27.2 μg/mL混合對照品溶液，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 供試品溶液的制備［7-10］取透皮接收液適量，加氨試液調(diào)節(jié)pH 為10 ～11，用三氯甲烷萃取5 次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，低溫蒸干，殘?jiān)?.01 mol/L 鹽酸溶液2 mL 溶解，過濾，即得。

2.1.3 色譜條件 Cromasil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm );柱溫30 ℃;流動相A 相為乙腈-四氫呋喃(25 ∶15)，B 相為0.1 mol/L 醋酸銨溶液(每1 000 mL 加冰醋酸0.5 mL)，梯度洗脫(0 ～48 min，15%→26%A;48 ～49 min，26%→35%A;49 ～58 min，35%A;58 ～65 min，35%→15% A);檢測波長為235 nm;體積流量為1 mL/min。

2.2 離體透皮吸收實(shí)驗(yàn)

2.2.1 離體小鼠皮膚的制備 取清潔級小鼠，處死后用電動剃須刀剃毛。剝離腹部皮膚，仔細(xì)剔除皮下脂肪和黏連物， -20 ℃保存，使用前自然解凍，皮膚在30 d 內(nèi)用完。

2.2.2 給藥池溶液的制備 制川烏組:稱取制川烏提取物適量，加純化水溶解，即得供給池液，其中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿等6 種酯型生物堿的質(zhì)量濃度分別為561.068、123.920、49.755、155.489、42.883、28.276 μg/mL;制川烏-白芍組:6 種酯型生物堿的質(zhì)量濃度同制川烏組，芍藥苷的質(zhì)量濃度為8.593 mg/mL。

2.2.3 體外透皮實(shí)驗(yàn) 采用YB-P6 型智能透皮試驗(yàn)儀，水浴溫度為(37 ±0.5)℃，攪拌速度轉(zhuǎn)速為200 r/min，有效透過面積為1.76 cm2，接收池容積為15 mL，接受液為生理鹽水。將皮膚平整鋪于供給池和接受池中間，表皮層面向供給池，真皮層面向接受池。在供給池、接受池中分別加入供給液及接受液，在2、5、10、24、48 h 時，從接收池中取出全部接受液(同時補(bǔ)加同溫的新鮮接受液)，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定，計(jì)算累計(jì)透過量Q。

2.2.4 數(shù)據(jù)處理 單位面積累積經(jīng)皮滲透量的計(jì)算公式Q= (ΣCi·Vi)/ A，以Q 對t 作曲線，并對曲線中的直線部分進(jìn)行回歸，求出直線斜率dQ/dt，即為藥物的穩(wěn)態(tài)滲透速率Jss(h·μg/cm2)。公式中Ci是第i 個取樣點(diǎn)測得的藥物濃度，i =1、2、3、4、5;V 為接收池的體積(15 mL);A 是擴(kuò)散池的擴(kuò)散面積 (A = 1.76 cm2)。用公式Papp=(dQ/dt)/C0計(jì)算表觀滲透系數(shù)，C0是給藥池中藥物的濃度。數(shù)據(jù)以±s 表示，用t 檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性比較，P ＜0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 接收液中6 種酯型烏頭生物堿測定方法學(xué)考察 在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿分別在82.8 ～2 484 ng、12.7 ～381 ng、12.3 ～369 ng、33.6 ～1 008 ng、37.8 ～1 134 ng、13.6 ～408 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測限分別為16.56 ng、7.62 ng、7.38 ng、20.16 ng、22.68 ng、10.88 ng，精 密 度 的RSD 分別為0.39%、1.81%、0.87%、1.20%、0.70%、1.95%，樣品溶液在16 h 內(nèi)穩(wěn)定，RSD分 別 為 0.30%、 1.65%、 1.79%、 0.48%、2.76%、2.30%，重復(fù)性試驗(yàn)的RSD 分別0.41%、1.65%、2.30%、2.61%、1.84%、3.92%。6 種酯型生物堿與皮膚浸出液中的組分及其他組分均能達(dá)到基線分離，且陰性無干擾，結(jié)果見圖1。

3.2 配伍對制川烏中6 種酯型烏頭生物堿經(jīng)皮吸收的影響 制川烏組與制川烏配伍白芍組中6 種酯型生物堿苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的透皮速率、滲透系數(shù)見表1，透皮曲線見圖2。

表1 6 種酯型烏頭生物堿經(jīng)皮滲透Q-t 回歸方程、透皮速率、滲透系數(shù)(±s，n=3)Tab.1 Q-t regression equations，permeation rates and coefficients of six aconitine alkaloids through excised mice skin in vitro(±s，n=3)

表1 6 種酯型烏頭生物堿經(jīng)皮滲透Q-t 回歸方程、透皮速率、滲透系數(shù)(±s，n=3)Tab.1 Q-t regression equations，permeation rates and coefficients of six aconitine alkaloids through excised mice skin in vitro(±s，n=3)

組別 成分 透皮方程Q-t Jss/(μg·cm -2·h -1) Papp/(10 - 7cm·s -1)+0.173 0.333 ±0.127 1.651 ±0.627苯甲酰烏頭原堿 Q=0.074t+0.028 0.074 ±0.034 1.655 ±0.731苯甲酰次烏頭原堿 Q=0.041t+0.781 0.048 ±0.022 2.678 ±1.247新烏頭堿 Q=0.137t+0.044 0.138 ±0.057 2.460 ±1.022次烏頭堿 Q=0.118t-0.057 0.117 ±0.052 7.607 ±3.387烏頭堿 Q=0.038t-0.254 0.036 ±0.014 3.544 ±1.430制川烏+白芍 苯甲酰新烏頭原堿 Q=0.662t+0.099 0.662 ±0.223 3.277 ±1.104苯甲酰烏頭原堿 Q=0.151t+0.095 0.152 ±0.058 3.397 ±1.313苯甲酰次烏頭原堿 Q=0.077t+0.275 0.088 ±0.014 4.889 ±0.811新烏頭堿 Q=0.275t+0.341 0.278 ±0.116 4.972 ±2.065次烏頭堿 Q=0.260t-0.201 0.258 ±0.112 16.722 ±7.296烏頭堿 Q=0.079t制川烏 苯甲酰新烏頭原堿 Q=0.332t-0.160 0.078 ±0.043 7.641 ±4.239

圖2 制川烏體外累積滲透曲線(n=3)Fig.2 In vitro percutaneous absorption curves of prepared aconite (n=3)

從表1、圖2 可以看出，制川烏白芍配伍后制川烏中單酯型烏頭生物堿苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的表觀滲透系數(shù)明顯增加 (P ＜0.05)，分別為未配伍組的1.99、2.05、1.83 倍;而雙酯型烏頭生物堿新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的的表觀滲透系數(shù)未見明顯升高(P ＞0.05)。

4 討論

制川烏中酯型烏頭生物堿，特別是雙酯型生物堿在高溫下不穩(wěn)定，容易水解成單酯型生物堿，常用的回流提取法提取到的雙酯型生物堿含有量極低，故本實(shí)驗(yàn)采用95% 的乙醇冷浸，低溫 (＜30 ℃)濃縮干燥，提高了生物堿的穩(wěn)定性。

以上研究證實(shí)，制川烏白芍配伍對單酯型生物堿和雙酯型生物堿的經(jīng)皮吸收存在明顯差異，這種差異可能與制川烏中酯型生物堿與芍藥苷之間結(jié)合形成的“離子對”(ion pair，IP)有關(guān)。在中藥成分之間形成“離子對”，已有文獻(xiàn)報(bào)道，如烏頭堿和甘草酸可以形成“離子對”而增加生物堿的脂溶性［11］，黃芩苷-血根堿也可以形成離子對化合物［12］，在研究“離子對”對脂溶性有機(jī)酸酮洛芬對經(jīng)皮滲透的影響時發(fā)現(xiàn)，有機(jī)胺(乙醇胺、二乙醇胺、二乙胺、三乙胺、三乙醇胺、N- (2-羥乙基)哌啶對酮洛芬有經(jīng)皮促進(jìn)作用［13］。故本實(shí)驗(yàn)基于以上實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，推測芍藥苷與制川烏生物堿也可能形成“離子對”而促進(jìn)相關(guān)成分的吸收，但有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

制川烏中主要含有6 種酯型烏頭生物堿，雙酯型烏頭堿新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿有大毒，使用不當(dāng)易引起中毒，炮制后，雙醋型生物堿水解后，轉(zhuǎn)化成單酯型烏頭堿，毒性大大降低，而仍能發(fā)揮療效［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制川烏白芍配伍后促進(jìn)了制川烏中單酯型生物堿苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的經(jīng)皮吸收。本研究從經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)的角度闡釋了制川烏白芍配伍“增效”的可能配伍機(jī)理。

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