劉用國, 許嬌紅, 張紅雷
(福建省藥品檢驗(yàn)所,福建 福州350001)
短葶山麥冬為百合科植物山麥冬屬短葶山麥冬Liriope muscari (Decne.)Baily 的干燥塊根,主產(chǎn)于福建泉州等地,多為栽培品[1],味甘、微苦,具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效。
短葶山麥冬中含有甾體皂苷類、多糖類等成分,研究表明,其水提物及皂苷類成分具有免疫調(diào)節(jié)、呼吸系統(tǒng)調(diào)節(jié)的功能,可降低血糖、抗腫瘤、抗炎、抗心律失常等功效[2-5]。目前對其多糖的研究報(bào)道主要集中于提取分離及多糖的定量測定,對于發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能機(jī)制的研究較少。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,LMP 對正常小鼠及環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠均有一定的免疫調(diào)節(jié)功能[6]。巨噬細(xì)胞通過對異物的吞噬、加工,向機(jī)體免疫系統(tǒng)呈遞抗原以及促進(jìn)自身釋放免疫因子,是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)。因此LMP 的免疫調(diào)節(jié)作用可能與巨噬細(xì)胞活性相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬、加工及促進(jìn)活性免疫因子分泌的影響,進(jìn)一步闡明其免疫調(diào)節(jié)的可能機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 短葶山麥冬Liriope muscari (Decne.)Baily的干燥塊根,采用水提醇沉法提取短葶山麥冬粗多糖,Sephadex G-100 凝膠柱對粗多糖進(jìn)行純化、精制[7],DNS法測定純度為83%。精密稱取LMP 50 mg,紫外照射30 min 滅菌,加入RPMI-1640 培養(yǎng)液5 mL,溶解后用0.22 μm 濾過,即得10 mg/mL 貯備液。
1.2 實(shí)驗(yàn)動物 BALB/c 小鼠,SPF 級,雄性,體質(zhì)量為20 ~23 g,上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動物場,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證SCXK (滬)2012-0011。
1.3 儀器與試劑
1.3.1 儀器 MettlerAE200 電子天平、Heraeus 低溫高速離心機(jī)、Biorad550 酶標(biāo)儀、Thermo 二氧化碳培養(yǎng)箱、Invitrogen 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、ESCO A2 生物安全柜、Leica 倒置顯微鏡、Leica DM2000 生物顯微鏡、Leica DFC295 成像系統(tǒng)。
1.3.2 試劑 MTT、脂多糖(LPS)、硫基乙酸鹽肉湯,購自Sigma 公司;PBS 緩沖液(pH 7.2 ~7.4)、RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液,購自杭州吉諾醫(yī)藥生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)(Gibco 公司);中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、牛血清白蛋白(BSA),購自碧云天公司;TNF-α(批號20131201)、IL-6 (批號20131210)檢測試劑盒,購自BOSTER 公司;Transwell 小室(6.5 mm 直徑,孔徑8.0 μm,聚碳酸酯濾膜)購自Corning 公司。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 小鼠腹腔注射含5%硫基乙酸鹽肉湯的氯化鈉注射用水1 mL,4 d 后頸椎脫臼處死,浸入95%乙醇30 s,將4 ℃預(yù)冷的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液注入小鼠腹腔,輕揉腹部1 ~2 min,回抽腹腔液體,4 ℃80 ×g 離心10 min,棄上清,用含10%胎牛血清的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液重懸后,將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)平皿上,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培育3 h 后,輕輕吸棄上清,再用37 ℃預(yù)熱PBS 洗滌3 次,洗去未貼壁細(xì)胞,得純化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,用含10%胎牛血清的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液重懸后,調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×106個/mL備用[8]。
1.4.2 給藥設(shè)計(jì)與分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)LMP 組、LPS 模型組和空白對照組,每組設(shè)3 個復(fù)孔。LMP 貯備液用RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成0.625、1.25、2.5、5 mg/mL 的溶液,實(shí)驗(yàn)時(shí)按1 份LMP ∶9 份含10%胎牛血清的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液加入培養(yǎng)體系中,使LMP 終質(zhì)量濃度分別為62.5、125、250、500 μg/mL。精密稱取LPS 適量,用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液超聲溶解,配制成100 μg/mL 的溶液,實(shí)驗(yàn)時(shí)按1 份LPS ∶9 份含10%胎牛血清的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液加入培養(yǎng)體系中,使LPS 終質(zhì)量濃度為10 μg/mL。
1.4.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測 分組給藥按“1.4.2”項(xiàng)的方法,調(diào)整細(xì)胞密度為5 ×105個/mL,每孔200 μL 加入到96 孔板中,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h,吸去培養(yǎng)液,用PBS 洗滌2 次,重新加入200 μL 含10%胎牛血清的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液,并加入20 μL 中性紅染液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h,去除含有中性紅染色液的培養(yǎng)液,用PBS 溶液洗滌2 次,每孔加入200 μL 中性紅檢測液,搖床上振蕩10 min,酶標(biāo)儀于540 nm 處測定吸光度值[9]。
1.4.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞趨化功能的檢測 腹腔巨噬細(xì)胞收集后,用含1% BSA 的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×106個/mL,趨化小室上室加入100 μL細(xì)胞懸液,下室加入600 μL 不同質(zhì)量濃度的LMP 溶液,小心振蕩使細(xì)胞分布均勻,置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h 后,取出小室,棄去小室內(nèi)細(xì)胞懸液,用擦鏡紙擦去小室內(nèi)未遷移細(xì)胞,用PBS 洗滌兩次后用3%戊二醛室溫固定30 min。37 ℃預(yù)熱的PBS 洗凈戊二醛后涼干,然后用0.25%結(jié)晶紫-甲醇染色15 min。37 ℃預(yù)熱的PBS 清洗小室3 次,除去多余染料,切下小室內(nèi)聚碳酸酯膜干燥后,顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移到小室下表面的巨噬細(xì)胞數(shù)。每個小室隨機(jī)觀察10 個視野。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次[10]。趨化結(jié)果以趨化指數(shù)(CI)表示。CI% = 給藥組10 個視野下的巨噬細(xì)胞數(shù)/對照組10 個視野下的巨噬細(xì)胞數(shù)×100%。
1.4.5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 的檢測 分組給藥按“1.4.2”項(xiàng)的方法,調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/mL,每孔200 μL 加入到96 孔板中,細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后,收集上清液,采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定,按試劑盒說明書操作,酶標(biāo)儀450 nm 處測定吸光度值[10]。
1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),方差齊的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用LSD 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì),方差不齊的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Tambane 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2.1 LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 由圖1 可知,LPS 10 μg/mL 的質(zhì)量濃度可以極大地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用,與對照組相比,有顯著差異 (P <0.01);LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的作用,在62.5 ~500 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),LMP 對中性紅的吞噬能力不斷增加,質(zhì)量濃度為250 μg/mL 時(shí)與對照組比較,有顯著差異(P <0.05);當(dāng)質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時(shí)與對照組比較,有顯著差異(P <0.01)。說明LMP 可提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力,且有一定的劑量相關(guān)性。
圖1 LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響(n=3)
2.2 LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞趨化功能的影響 與對照組相比,LMP 125、250、500 μg/mL 3 組均可顯著提高腹腔巨噬細(xì)胞的趨化指數(shù)CI (P <0.01),對腹腔巨噬細(xì)胞趨化能力提高百分率分別為27.8%、31.0%、74.0%。說明LMP 可以增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞的趨化功能,且對多糖的質(zhì)量濃度有一定依賴性,結(jié)果見圖2。
圖2 LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞趨化功能的影響(n=4)
2.3 LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 的影響結(jié)果見圖3,LPS 可明顯促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNFα、IL-6,與對照組相比,均有顯著性差異(P <0.01)。當(dāng)不同質(zhì)量濃度LMP 與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞相作用時(shí),62.5、125 μg/mL 兩個質(zhì)量濃度LMP 對TNF-α 和IL-6 釋放量與對照組相比,無明顯變化(P >0.05);當(dāng)LMP 質(zhì)量濃度為250 μg/mL 時(shí),測得TNF-α 的量為(130.0 ±22.4)pg/mL,與對照組相比釋放量雖有所提高,但也無顯著差異(P >0.05);測得IL-6 分泌量為(282.5 ±33.4)pg/mL,與對照組相比,有顯著性差異(P <0.01);當(dāng)LMP 質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時(shí),TNF-α 和IL-6 分泌量均可促進(jìn),分別達(dá)(185.5 ±15.3)pg/mL 和(352.5 ±28.1)pg/mL。
圖3 LMP 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6 的影響(n=3)
巨噬細(xì)胞通過吞噬外來抗原或半抗原,進(jìn)而分泌各種活性免疫因子,調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來保護(hù)機(jī)體。病原菌和免疫因子等可誘導(dǎo)體內(nèi)靜息的巨噬細(xì)胞活化,并分化成熟為活化的巨噬細(xì)胞M1 (classically activated macrophage)和M2(alternatively activated macrophage)[11-12],M1 細(xì)胞分泌IL-1、IL-6、NO、TNF-α 等炎癥介質(zhì),刺激Th1 依賴性免疫反應(yīng),M2 細(xì)胞可分泌抗炎癥因子如IL-10、TGF-β,促進(jìn)Th2免疫應(yīng)答。
小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離純化的試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)未活化的腹腔巨噬細(xì)胞,即未注射5%硫基乙酸鹽肉湯的小鼠,不僅腹腔巨噬細(xì)胞獲得少,每只約1 ×106個/mL,且對LPS和LMP 刺激時(shí)吞噬能力、趨化作用和分泌TNF-α、IL-6 不太敏感。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示250、500 μg/mL LMP 可不同程度的提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力、趨化作用和分泌TNF-α、IL-6 的作用。因此初步認(rèn)為LMP 通過提高巨噬細(xì)胞活化能力,刺激Th1 依賴性免疫反應(yīng),產(chǎn)生炎癥因子來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫。但LMP 通過何種途徑與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合,從而激活巨噬細(xì)胞,還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察來說明。
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