海南產(chǎn)紅樹植物老鼠中2-苯并唑啉酮分離鑒定及含量測(cè)定

張宏武 丁 剛 李榕濤 魏建和 鄒忠梅

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院藥用植物研究所，北京100193；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院藥用植物研究所海南分所，海南萬寧571533

張宏武1丁 剛1李榕濤2魏建和1鄒忠梅1

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院藥用植物研究所，北京100193；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院藥用植物研究所海南分所，海南萬寧571533

目的分離制備海南產(chǎn)紅樹植物老鼠簕中指標(biāo)性成分并建立其含量測(cè)定方法。方法選擇老鼠簕高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（HPLC-DAD）色譜中的主要成分作為其指標(biāo)性成分進(jìn)行分離鑒定，并應(yīng)用HPLC建立其含量測(cè)定方法，色譜條件為：Shiseido（Pak-C18）色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相：乙腈-水（35∶65）。流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm，柱溫：30℃。結(jié)果從老鼠簕中分離鑒定了1個(gè)生物堿成分2-苯并唑啉酮，并建立了HPLC含量測(cè)定方法，在0.004 32～1.08 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.9999，n=5）。平均回收率（n=9）為97.54%。結(jié)論本方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可用于海南產(chǎn)老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮的含量測(cè)定。

老鼠簕；生物堿；高效液相色譜法

紅樹植物（Mangrove plants）是熱帶、亞熱帶海區(qū)潮間帶特有的木本植物，我國(guó)利用紅樹植物作為藥用已有較長(zhǎng)的歷史，尤其是民間用藥。老鼠簕（Acanthus ilicifolius L.）為爵床科老鼠簕屬植物，又名老鼠怕、軟骨牡丹、蚧瓜等，其性寒，味淡，全株或根入藥，為紅樹林重要的藥用植物之一，與其他紅樹林植物共生于海灘及淺海中。全世界共有50種，其中屬于紅樹林的老鼠簕、小花老鼠簕（A.ebracteatus Vahl）和廈門老鼠簕（A.xianmensis Zhang）主要分布在我國(guó)廣西、廣東、海南、臺(tái)灣、福建和浙江南部沿海海岸［1］。民間廣泛用于治療急慢性肝炎、哮喘、風(fēng)濕病、麻痹癥、蛇傷等，有鎮(zhèn)痛和抗感染作用。在海南民間常用老鼠簕消腫、解毒、治療淋巴結(jié)腫大、急性肝脾疼痛、黃疸、胃痛和哮喘，將其根搗碎水煮，加上蜂蜜口服，是治療乙型肝炎的特效藥［2］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗肝纖維化［3］和抗氧化［4-5］、抗腫瘤［6］、抗菌［7］、抗感染鎮(zhèn)痛［8］、預(yù)防骨質(zhì)疏松［9］等作用?；瘜W(xué)成分研究表明老鼠簕主要含有生物堿、黃酮類、皂苷、甾醇類化學(xué)成分［10-14］，其中生物堿類成分是其抗感染、止痛活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究表明：老鼠簕中的2-苯并唑啉酮具有殺利什曼原蟲的作用［15］。目前尚未見對(duì)海南產(chǎn)老鼠簕植物質(zhì)量控制的報(bào)道，為了開發(fā)利用海南的紅樹植物資源，筆者首次對(duì)海南產(chǎn)紅樹植物老鼠簕藥材的質(zhì)量做了進(jìn)一步的評(píng)價(jià)，對(duì)老鼠簕中的指標(biāo)性成分——2-苯并唑啉酮，進(jìn)行了分離制備和結(jié)構(gòu)測(cè)定，并首次對(duì)其海南產(chǎn)8批老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮含量進(jìn)行了測(cè)定。該方法可靠、靈敏、重復(fù)性好，可以很好地控制藥材的質(zhì)量，為海南產(chǎn)老鼠簕藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器Fisher-Johns熔點(diǎn)儀（溫度未校正）；Bruker-AM600核磁共振波譜儀（TMS做內(nèi)標(biāo)）；996-2487高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）：600泵；PDA紫外可見檢測(cè)器；empower工作站，電子天平（MSA125P-100-DU，賽多利斯，德國(guó)）；超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。柱色譜Sephadex LH-20為Pharmacia公司產(chǎn)品，薄層色譜及柱色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品。

試劑：色譜乙腈（Burdick&Jackon，美國(guó)）；娃哈哈純凈水；其余試劑均為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

樣品：8批海南產(chǎn)老鼠簕樣品分別于2008、2009年采自海南文昌、瓊山地區(qū)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院海南分所助理研究員李榕濤鑒定為爵床科老鼠簕屬植物A-canthus ilicifoliusL.的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

取老鼠簕藥材1 kg，粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，用95%乙醇回流提取2次，每次2 h，提取液減壓回收溶劑至無醇味，得浸膏115 g，將115 g浸膏加適量水混懸后，用8倍量乙酸乙酯萃取3次。合并萃取液，并減壓濃縮，得到乙酸乙酯部分5 g。將乙酸乙酯部分反復(fù)經(jīng)硅膠（100～200目）柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇（100∶0～0∶100）系統(tǒng)梯度洗脫，并經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，用二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到化合物32.8 mg，經(jīng)NMR鑒定為2-苯并唑啉酮。

2.2 2-苯并口惡唑啉酮對(duì)照品核磁數(shù)據(jù)

1H-NMR（600 MHz，CDCl3），δ7.21（1H，dd，H-7），7.16（1H，dd，H-4），7.12（2H，td，H-5，6）。13C-NMR（150 MHz，CDCl3），156.2（C-2），144.1（C-7a），129.5（C-3a），124.4（C-5），123.0（C-6），110.4（C-4），108.5（C-7）。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido（Pak-C18）色譜柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）（日本）；流動(dòng)相：乙腈-水（35∶65）。流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。按2-苯并唑啉酮峰計(jì)算，理論塔板數(shù)不低于4500。此色譜條件下，待測(cè)組分與其他組分均達(dá)到基線分離，符合定量要求。色譜分離見圖1。

圖1 老鼠簕樣品和2-苯并口惡唑啉酮對(duì)照品的高效液相色譜圖

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 供試品溶液的制備取老鼠簕藥材2.0 g（過60目篩）置于50 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL甲醇，搖勻，充分溶解后，稱重，超聲提取20 min（功率：200 W；頻率：40 kHz），冷卻，加適量甲醇復(fù)重，再次超聲提取20 min，冷卻，加適量甲醇復(fù)重，合并濾液，置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定量轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，冷卻，加甲醇至刻度，搖勻。0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線性的測(cè)定

2.3.4 檢測(cè)限及定量限

精密量取“2.3.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液定量稀釋，以信噪比S/N為3∶1，測(cè)得2-苯并唑啉酮的最低檢測(cè)限為0.43 ng/mL；以信噪比S/N為10∶1，測(cè)定2-苯并唑啉酮最低定量限為1.73 ng/mL（S/N≥10）。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批老鼠簕藥材粉末5份，按“2.3.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備5份供試品液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于1%，相對(duì)峰面積的RSD為0.95%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 精密度試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定5次，記錄色譜圖，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于1%，相對(duì)峰面積的其日間精密度的RSD為0.52%，日間精密度的RSD為1.70%。表明該方法精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次供試品溶液，分別于0、4、8、24、48 h分別按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于1%，相對(duì)峰面積的RSD為1.2%。表明供試品在48 h內(nèi)基本性良好。

2.3.8 回收率試驗(yàn)

精密稱取同一已知含量的老鼠簕藥材粉末約1.0 g，共9份，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，每3份一組，按老鼠簕藥材中對(duì)照品含量的120%、100%、80%，即高、中、低濃度分別加入適量2-苯并唑啉酮對(duì)照品溶液（1.13 mg/mL），然后按“2.3.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，測(cè)定結(jié)果，計(jì)算得到高、中、低濃度2-苯并唑啉酮的加樣回收率分別為97.55%、97.27%、97.80%，平均加樣回收率為97.54%，RSD為 0.97%（n=3），結(jié)果見表1。

表12 -苯并口惡唑啉酮加樣回收率（n=3）

2.3.9 樣品測(cè)定

取8批老鼠簕藥材粉末，按“2.3.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備樣品，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮的含量。結(jié)果見表2。

表2 老鼠簕藥材中2-苯并口惡唑啉酮含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 對(duì)照品的選擇

3.2 提取方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)曾分別用二氯甲烷、95%乙醇和甲醇作為提取溶劑，超聲提取老鼠簕中2-苯并唑啉酮：提取2次，每次20 min，合并濾液，純甲醇定容于5 mL量瓶中，高效液相色譜（HPLC）測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取物中2-苯并唑啉酮最高。在確定提取溶劑后，又對(duì)甲醇超聲提取和回流提取方式及提取次數(shù)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明：甲醇超聲提取和回流提取對(duì)老鼠簕中2-苯并唑啉酮的含量影響不大，考慮到超聲提取方法簡(jiǎn)便，易行，故選擇超聲提取方法，作為提取方法。對(duì)提取時(shí)間的考察：分別提取10、20、45、60 min，10 min不能完全提取，20 min和45 min結(jié)果基本相同，而60 min的結(jié)果比45 min略低，故選擇提取20 min。所以最后確定提取方法為：甲醇超聲提取2次，每次20 min。

3.3 流動(dòng)相的篩選

本試驗(yàn)對(duì)甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水這三種流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了篩選比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)和甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)存在色譜峰拖尾的現(xiàn)象，而換用乙腈-水系統(tǒng)即可得到滿意的色譜峰形，同時(shí)與其他雜質(zhì)峰的分離度也很高。故選擇乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，并調(diào)節(jié)流動(dòng)相，最終選擇乙腈-水（35∶65）作為洗脫溶劑，老鼠簕藥材中2-苯并惡唑啉酮與其他組分得到較好的分離，且峰形對(duì)稱，出峰時(shí)間適宜，適合作為老鼠簕藥材中2-苯并惡唑啉酮含量測(cè)定用流動(dòng)相。

3.4 耐用性的考察

本實(shí)驗(yàn)換用Agilent（SB-C18）色譜柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），用適當(dāng)乙腈和水等度洗脫，2-苯并惡唑啉酮也達(dá)到基線分離，結(jié)果表明該方法耐用性較好。

3.5 柱溫和檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用30℃柱溫，可以減少流動(dòng)相黏度、降低柱壓并改善分離效果，同時(shí)降低環(huán)境對(duì)分離的影響程度，故將柱溫定為30℃。用二極管陣列檢測(cè)器在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，通過觀察2-苯并惡唑啉酮的紫外圖譜，發(fā)現(xiàn)2-苯并惡唑啉酮在270 nm左右處有最大吸收，并且在270 nm處測(cè)定基線波動(dòng)小，峰形理想，樣品中其他組分干擾小，所以選擇270 nm作為HPLC的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本方法直接進(jìn)樣，不需要進(jìn)行前處理，雜質(zhì)峰與樣品峰能達(dá)到基線分離，且在該色譜條件下2-苯并惡唑啉酮對(duì)照品峰形均勻?qū)ΨQ，證明本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，重復(fù)性好，且該方法的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、精密度、回收率試驗(yàn)均均能滿足定量的要求，且專屬性好，故可以用于海南產(chǎn)紅樹植物老鼠簕中2-苯并惡唑啉酮的含量測(cè)定。

3.6 樣品測(cè)定結(jié)果

從海南不同產(chǎn)地的8批老鼠簕藥材中2-苯并惡唑啉酮含量測(cè)定的結(jié)果來看，8批老鼠簕藥材中2-苯并惡唑啉酮含量差異比較大，因此有必要對(duì)老鼠簕藥材的采集、種植做進(jìn)一步的系統(tǒng)研究及規(guī)范，從而保證老鼠簕藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性。

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Isolation,identification and quantitative analysis of 2-Benzoxzololinone in Mangrove Acanthus ilicifolius L.from Hainan Province

ZHANG Hongwu1DING Gang1LI Rongtao2WEI Jianhe1ZOU Zhongmei1
1.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Science&Peking Union Medical College, Beijing100193,China;2.Hainan Branch Institute of Medicinal Plant,Chinese Academy of Medical Science&Peking Union Medical College,Hainan Province,Wanning571533,China

ObjectiveTo reporte the isolation of 2-Benzoxzololinone alkaloid from the roots of Acanthus ilicifolius L. and establish a HPLC method to determine the content of the 2-Benzoxzololinone alkaloid in the root of Mangrove A-canthus ilicifolius L.from Hainan Province.MethodsA Shiseido(Pak-C18)(5 μm,4.6 mm×150 mm)column was used with a mobile phase of acetonitrile-water(35∶65).The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was setted at 30℃.The detection wavelength was 270 nm.ResultsThe linear range of 2-Benzoxzolol was 0.004 32～1.08 mg/mL (r=0.9999,n=5)and the average recovery(n=9)was 97.54%.ConclusionThe method is accurate,simple,reproducible,and can be used to determine the content of 2-Benzoxzololinone alkaloid in Acanthus ilicifolius L.from Hainan Province.

Acanthus ilicifolius L.;Alkaloid;HPLC

R284

A

1673-7210（2015)02（b)-0106-04

2014-10-31本文編輯：衛(wèi)軻）

張宏武（1977.5-），女，碩士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。

鄒忠梅（1964.4-），女，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。