結(jié)直腸腺癌組織中c—JUN氨基末端激酶、E—選擇素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子—D蛋白表達(dá)的臨床意義

慶琳琳　胡繼春

[摘要] 目的 探討c-JUN氨基末端激酶（c-JUN）、E-選擇素（E-selectin）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D蛋白（VEGF-D）蛋白在結(jié)直腸腺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用。 方法 收集2012年8月～2014年9月于北京市海淀醫(yī)院手術(shù)切除的正常大腸黏膜組織標(biāo)本（20例）和結(jié)直腸腺癌標(biāo)本（50例），應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)標(biāo)本中c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白的表達(dá)，觀(guān)察c-JUN、E-selectin、VEGF-D與臨床病理的聯(lián)系及c-JUN與E-selectin、VEGF-D的相關(guān)性。 結(jié)果 ①結(jié)直腸癌組織中，c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率（84%、78%、92%）顯著高于正常大腸黏膜組織（5%、10%、10%），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；②c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白的表達(dá)與Dukes分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P < 0.05）；③c-JUN與E-selectin呈正相關(guān)（r = 0.6394，P < 0.05），c-JUN與VEGF-D呈正相關(guān)（r = 0.6592，P < 0.05）。 結(jié)論 E-selectin、VEGF-D蛋白與結(jié)直腸腺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，c-JUN可能調(diào)控E-selectin、VEGF-D的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌；c-JUN氨基末端激酶；E-選擇素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D蛋白

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.24 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）02（b）-0095-04

[Abstract] Objective To investigate the role of c-JUN， E-selectin， VEGF-D protein in the development and metastasis of colorectal carcinoma. Methods From August 2012 to September 2014， 20 normal tissues and 50 colorectal carainomas samples from surgical resection in Beijing Haidian Hospital were selected. The expression of c-JUN， E-selectin， VEGF-D protein in these samples were detected by immunohistochemistry， the relationship of c-JUN， E-selectin， VEGF-D with clinical pathologh was observed， and the correlation of c-JUN with E-selectin and VEGF-D was analyzed. Results ①The positive rate of c-JUN， E-selectin， VEGF-D protein （84%， 78%， 92%） in colorectal tumor tissues were significantly higher than those in normal tissues （5%， 10%， 10%）， the differences were statistically significant （P < 0.01）. ②The positive rates of c-JUN， E-selectin， VEGF-D protein were associated with Dukes stage and lymph node metastasis （P < 0.05）. ③A significant positive relation was observed between the positive rate of c-JUN and E-selectin （r = 0.6394， P < 0.05）， and a significant positive relation was observed between the positive rate of c-JUN and VEGF-D （r = 0.6592， P < 0.05）. Conclusion The expression of c-JUN， E-selectin， VEGF-D protein may be involved in the development and metastasis. The expression of E-selectin and VEGF-D may be regulated by c-JUN protein.

[Key words] Colorectal carcinoma； c-JUN； E-selectin； VEGF-D

結(jié)直腸腺癌是一種發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率有增高的趨勢(shì)，其生長(zhǎng)迅速與轉(zhuǎn)移的特性一直為研究者所關(guān)注，病理學(xué)改變最顯著的特征是新生血管及淋巴管生成，研究表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D（vascular endothelial growth factor D，VEGF-D）在瘤體組織中高表達(dá)與以上病理改變可能有相關(guān)性[1-2]。另外，E-選擇素（E-selectin）同樣可以在某些腫瘤組織中有高表達(dá)，可能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，增加血管基底膜的通透性，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3]，但VEGF-D和E-selectin在結(jié)直腸腺癌組織中的同時(shí)表達(dá)是否與腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移有關(guān)則研究較少。近年來(lái)，腫瘤研究中基因調(diào)控的觀(guān)點(diǎn)逐漸被提出并證明，即腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展都由某些信號(hào)傳導(dǎo)通路所控制，而在這些通路中的關(guān)鍵蛋白因子可能是影響腫瘤形成與轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵位點(diǎn)。在結(jié)直腸腺癌中，參與機(jī)體中多種重要免疫反應(yīng)的c-JUN氨基末端激酶（c-JUN NH2-terminal kinase，c-JUN）是否對(duì)E-selectin和VEGF-D的表達(dá)有調(diào)控作用也是需要研究的關(guān)鍵點(diǎn)?；谝陨涎芯勘尘埃狙芯渴占z測(cè)結(jié)直腸腺癌組織中c-JUN、VEGF-D、E-selectin蛋白的表達(dá)并探討與病理特征的相關(guān)性，分析臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年8月～2014年9月于北京市海淀醫(yī)院普通外科手術(shù)切除的50例結(jié)直腸癌組織和20例正常大腸組織（非結(jié)直腸癌）。結(jié)直腸癌患者50例中，男37例，女13例；年齡37～78歲；結(jié)直腸癌Dukes分期：A期5例，B期17例，C期20例，D期8例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例；術(shù)前均未接受放、化療及免疫治療，術(shù)后均經(jīng)病理檢查證實(shí)。非結(jié)直腸癌患者20例中，男14例，女6例，年齡30～72歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白檢測(cè)

試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司，所有組織均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm厚病理切片，貼附于多聚賴(lài)氨酸的載玻片上。采用免疫組化SP法檢測(cè)，一抗均為鼠抗人單克隆抗體，DAB顯色，全部操作過(guò)程均按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液（PBS）替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[4]

采用雙人雙盲法判定，免疫組化陽(yáng)性初步判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核或細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中同時(shí)出現(xiàn)棕黃色顆粒，①陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選取4個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，0分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比為0，1分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%，2分為10%<陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比≤50%，3分為50%<陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤75%，4分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>75%。②染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)顯色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。免疫組化最終結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積< 3為免疫組化結(jié)果陰性，≥3為免疫組化結(jié)果陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS 12.00對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman相關(guān)分析法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3 討論

結(jié)直腸腺癌作為一種發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤，已經(jīng)被基礎(chǔ)與臨床研究工作者所關(guān)注，從病理特征上觀(guān)察，其具有其他惡性腫瘤的共同特點(diǎn)：瘤體失控性迅速生長(zhǎng)，并發(fā)生原發(fā)腫瘤部位以外的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。對(duì)于惡性腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，雖然其確切的機(jī)制未完全闡明，但大量病理研究結(jié)果表明：腫瘤組織內(nèi)可見(jiàn)新生血管及淋巴管大量形成，這些新生血管一方面可以為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)支持，另一方面可能為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供條件。所以，腫瘤組織內(nèi)新生血管與淋巴管的大量增生是腫瘤生長(zhǎng)與發(fā)展的必要條件，研究分析這些病理改變的相關(guān)因素可能為進(jìn)一步了解腫瘤的發(fā)病機(jī)制提供新的途徑。

在正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)存在一個(gè)“精密”的調(diào)控體系，對(duì)于一般性損傷所需要的修復(fù)可以通過(guò)一些“免疫因子”來(lái)完成，VEGF是一類(lèi)能促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)的免疫因子，可以由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生釋放，促進(jìn)血管形成及生長(zhǎng)[5]，在正常生理?xiàng)l件下，VEGF表達(dá)較少，但在病理?xiàng)l件下，在某些惡性腫瘤組織中可以檢測(cè)到其高表達(dá)，已有研究報(bào)道在乳腺癌、肝癌、大腸癌等腫瘤疾患中VEGF有高表達(dá)[6-8]。VEGF-D是VEGF的一個(gè)亞型，與VEGF-C有近50%的基因同源性，據(jù)研究主要作用是促進(jìn)新生血管生長(zhǎng)，并且可以增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)[9]，在胃腸道腫瘤疾患中，VEGF-D在腫瘤組織內(nèi)特異性染色檢查顯示有高表達(dá)，表明可能有促進(jìn)腫瘤組織中新生血管形成的作用，即VEGF-D對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。所以，最新的觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為VEGF-D是一種較強(qiáng)的腫瘤生長(zhǎng)刺激因子。本研究觀(guān)察也驗(yàn)證了這一觀(guān)點(diǎn)：在結(jié)直腸腺癌中，VEGF-D表達(dá)增高，并隨腫瘤的病理分期進(jìn)展而持續(xù)增加，同時(shí)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中有較高表達(dá)，提示其與結(jié)直腸癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤特征的另一大表現(xiàn)，據(jù)研究，惡性腫瘤細(xì)胞可以浸潤(rùn)性生長(zhǎng)并突破血管的基底膜進(jìn)入血液循環(huán)發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，其相關(guān)作用機(jī)制較為復(fù)雜，可能有多種相關(guān)免疫蛋白參與，經(jīng)過(guò)多年研究，現(xiàn)在一致的觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為：首先，是惡性腫瘤細(xì)胞自身會(huì)發(fā)生變異，逃避機(jī)體免疫免疫系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與清除；其次，某些活性免疫蛋白分子可以在瘤體局部活性增高，誘使腫瘤細(xì)胞較易發(fā)生局部位移，突破血管基底膜進(jìn)入血液循環(huán)，最終發(fā)生距離較遠(yuǎn)的遷移與種植[10]。E-selectin是一種免疫因子，屬于選擇素家族中的一個(gè)重要成員，可以由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，作用為促進(jìn)炎性反應(yīng)細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）與血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附，為炎性細(xì)胞到達(dá)炎癥部位發(fā)揮作用而創(chuàng)造條件[11]。在某些腫瘤疾患中，E-selectin的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移可能存在密切的聯(lián)系，如胃癌患者腫瘤組織內(nèi)和血清中都可以檢測(cè)到E-selectin分泌水平高于正常健康人，并與腫瘤分級(jí)和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[12]。本研究結(jié)果也可以觀(guān)察到E-selectin在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)增高，與VEGF-D一樣，隨腫瘤病理分期加深和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而進(jìn)一步增加。

近年來(lái)，在腫瘤相關(guān)研究中，基因調(diào)控的觀(guān)點(diǎn)備受關(guān)注，即許多免疫蛋白的表達(dá)都可能有一個(gè)或幾個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控，在這些途徑上的關(guān)鍵調(diào)控因子則成了研究的熱點(diǎn)[13]。C-JUN是機(jī)體內(nèi)一個(gè)重要的調(diào)控通路的位點(diǎn)，屬于有絲分裂原活化蛋白激酶（Mitogen actived protein kinase，MAPK）的一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳到通路，與細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、增殖有關(guān)[14]。有研究表明[15-16]：腫瘤組織內(nèi)免疫組化檢測(cè)可見(jiàn)c-JUN蛋白呈強(qiáng)染色表達(dá)，提示腫瘤細(xì)胞增生分化可能有c-JUN蛋白信號(hào)傳導(dǎo)通路參與，但具體作用機(jī)制未完全闡明。在本研究中也可以觀(guān)察到c-JUN的表達(dá)增高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示c-JUN與VEGF-D和E-selectin的表達(dá)均有正相關(guān)性，此結(jié)果提示 c-JUN蛋白可能是VEGF-D和E-selectin蛋白分泌的一個(gè)上位調(diào)控位點(diǎn)，c-JUN增高，促進(jìn)VEGF-D和E-selectin的相應(yīng)增高，提示 c-JUN對(duì)VEGF-D和E-selectin有調(diào)控作用。c-JUN是上位控制蛋白，而VEGF-D和E-selectin是下位“靶蛋白”，在正常情況下，應(yīng)該存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)，但腫瘤疾患中，原有的調(diào)節(jié)系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)紊亂，可能出現(xiàn)與正常調(diào)節(jié)相反的正反饋調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。依據(jù)以上推論，假設(shè)如果能控制腫瘤組織中c-JUN的高表達(dá)，是否可以控制VEGF-D和E-selectin的過(guò)量分泌，但從現(xiàn)今的研究進(jìn)展看，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多種免疫蛋白參與的復(fù)雜過(guò)程，更加復(fù)雜的是多種免疫蛋白還存在相互作用的網(wǎng)絡(luò)性[17-18]，c-JUN信號(hào)傳導(dǎo)通路可能并非是結(jié)直腸癌中唯一的信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控通路，隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展勢(shì)必有更多的信號(hào)傳導(dǎo)通路會(huì)被發(fā)現(xiàn)，所以現(xiàn)在的研究結(jié)果并非能全面闡述腫瘤的發(fā)生與演變，特別是僅幾個(gè)免疫蛋白的表達(dá)變化并不能完全反映機(jī)體整體的免疫變化，還需要大量的研究提供重要的線(xiàn)索來(lái)充分闡明腫瘤發(fā)生與發(fā)展的確切作用機(jī)制，為將來(lái)更多的有效治療提供新的依據(jù)。

本研究對(duì)結(jié)直腸癌組織中VEGF-D和E-selectin的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示兩者表達(dá)的共同增加是一個(gè)明顯的特征性改變，VEGF-D可以促進(jìn)血管及淋巴管不斷增生，瘤體血運(yùn)豐富，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，但腫瘤細(xì)胞僅在局部生長(zhǎng)而不能移動(dòng)，則不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移必然需要其他免疫因子的幫助，E-selectin可能起到了關(guān)鍵作用，其在腫瘤組織內(nèi)部大量表達(dá)，推測(cè)可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，一旦突破了基底膜，腫瘤細(xì)胞便會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移。兩者之間還可能存在協(xié)同促進(jìn)作用，但具體機(jī)制還需要更加深入的研究。

綜上所述，VEGF-D和E-selectin與結(jié)直腸癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移有關(guān)，c-JUN可能調(diào)控VEGF-D和E-selectin的表達(dá)。但由于本研究結(jié)果還有很大的局限性，更確切的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2014-11-08 本文編輯：蘇 暢）